Protein ? Disassembly im Verlauf der endosomalen Prozessierung

Material und Methoden Seite 50
2.5.1 In vitro Verdauung der unmarkierten Modellantigene
Die Inkubation der Modellantigene mit den Proteasen fand bei 37°C statt. Die Konzent-
ration an Protease wurde so gewählt, dass das jeweilige Enzym mittels Silberfärbung
nicht nachweisbar war. Die Konzentration an Modellantigen wurde so gewählt, dass ei-
nerseits das Gel nicht überladen wurde, andererseits jedoch die proteolytischen Frag-
mente gut nachweisbar waren. Um den in vivo Bedingungen möglichst nahe zu kom-
men, wurden die pH - Werte der Puffer auf pH 5,9 bzw. pH 4,6 eingestellt. Um den Puf-
fer durch Zugabe der Antigenlösung nicht zu erschöpfen, waren die Antigene im jeweili-
gen Puffer in einer Konzentration von 2,5mg/ml gelöst. Das Endvolumen des Ansatzes
betrug 40 µl, die Inkubationsdauer variierte von 1-4 Stunden.
Kontrolle Prot. + B Prot. + D Prot. +BD
Protein 10µl 10µl 10µl 10µl
Kathepsin B — 3 µl — 3 µl
Kathepsin D — — 3 µl 3 µl
DTT 1 µl 1 µl 1 µl 1 µl
Puffer 29µl 26µl 26µl 23µl
Tab. 7 Pipettierschema des In Vitro Verdau
unmarkierter Proteine
Die Proben wurden nach obigen Schema pipettiert und bei 37°C inkubiert. Nach Been-
digung der Inkubationszeit wurden die Proben kurz zentrifugiert. Zum Stoppen der Re-
aktion wurden die Proben mit 40 µl Laemmli - Puffer versetzt und gelelektrophoretisch
aufgetrennt. Der Nachweis erfolgte mittels Silberfärbung.
2.5.2 In vitro Verdauung der markierten Modellantigene
Der in vitro Verdau der markierten Proteine wurde gegenüber der Verdauung der un-
markierten Proteine leicht modifiziert. Durch die erheblich höhere Nachweisempfind-
lichkeit der Chemiluminiszenzreaktion bzw. Fluoreszenz gegenüber der Silberfärbung
konnte die eingesetzte Proteinmenge um den Faktor zehn reduziert werden. Nach der
Markierung lag das Protein in einer Konzentration von 2,5 mg/ml vor. Um das Verhält-
nis Protease zu Protein nicht zugunsten der Protease zu verschieben, wurde die einge-
setzte Proteasekonzentration ebenfalls verringert. Die Endkonzentration des Ansatzes
betrug 40 µl, der pH betrug 5,9 bzw. 4,6.