Protein ? Disassembly im Verlauf der endosomalen Prozessierung

Material und Methoden Seite 54
Dichteeinheit bei 260nm entspricht 40 µg RNA pro ml. Während bei λ = 260nm vorwie-
gend Nukleinsäuren absorbieren, zeigen Proteine eine Absorption bei λ = 280nm. Das
Verhältnis der Absorption bei diesen beiden Wellenlängen erlaubt Aussagen über den
Reinheitsgrad der RNA – Präparation: Der Quotient aus OD260 zu OD280 sollte 1,8 – 2,0
betragen. Verunreinigungen mit Proteinen lassen das Verhältnis kleiner werden.
2.7.2 Gelelektrophoretische Auftrennung von Nukleinsäuren
• TAE 50-fach 2 M Tris (242 g/l)
50 mM EDTA
5,71 % (v/v) Eisessig
ad 100% Aqua bidest.
• Trenngel 1 % (w/v) Agarose Type II (Sigma)
2% (v/v) TAE 50-fach
0,01% (v/v) Ethidiumbromidlösung
ad 100% DEPC-H2O
• Elektrophoresepuffer 2 % (v/v) TAE 50-fach
ad 100% DEPC-H2O
• Ladepuffer 50 % (w/v) Glyzerin
1mMEDTA
0,4 % (w/v) Bromphenolblau
0,4 % (w/v) Xylencyanol
• Gelträger
• Probenkamm
• Elektrophoresekammer DNA-Mini-Sub-Cell (Bio-Rad)
Zur Herstellung des Agarose – Trenngels wurde die Agarose in DEPC-H2O durch Aufko-
chen in der Mikrowelle gelöst. Nach Abkühlen der Lösung auf ca. 60°C wurden die üb-
rigen Gelkomponenten zugesetzt, gemischt und in einen vorbereiteten Gelträger gefüllt.
Mit einem Kunststoffkamm wurden Startkanäle für die Nukleinsäure - Proben ausge-
spart. Das Gel wurde nach dem Erkalten in eine Elektrophoresekammer überführt, die
mit Elektrophoresepuffer gefüllt wurde, bis das Gel etwa 1mm bedeckt war. Die zu un-
tersuchende Probe wurde mit 1µl Ladepuffer versetzt, mit DEPC-H2O auf10µlaufgefüllt
und in die Probentaschen pipettiert. Die Elektrophorese erfolgte bei 100V, bis der Farb-
marker das Gelende erreicht hatte.