Protein ? Disassembly im Verlauf der endosomalen Prozessierung

Material und Methoden Seite 40
Das gekoppelte Enzym setzt ein spezifisches Substrat um, das entweder zu einer visuel-
len oder spektrometrisch detektierbaren Farbreaktion bzw. zu einer Chemilumineszenz
in Form einer kalten Lichtemmission führt. Bei der hier eingesetzten Chemiluminiszenz
konnten die Signale über einen Röntgenfilm detektiert werden.
Zusätzlich zum indirekten Nachweis über eine antikörpervermittelte Reaktion konnten
Fluorescein – markierte Proteine direkt durch Aktivierung der Fluoreszenz nachgewiesen
werden.
2.3.8.1 Materialien und Lösungen
• BM Chemilumineszenz Western- Blotting Kit (Biotin/Streptavidin) (Boehringer, Mannheim)
• Folienschweißgerät Typ 244 (Schott, Germany)
• Hybrdisierungsbeutel (Gibco, Schottland)
• Röntgenfilmkassetten X-Omatik (Kodak, Stuttgart)
• Tween 20
• α- Dig - AP Stlsg. (250 U/200 µl) (Roche)
• α- Dig - AP Arb.lsg. 23,75 ml TBS
1,25 ml Block.St.lsg. B
1µlAnti-Dig-APStlsg.
• Block.Stlsg A 10 ml Blockierungsreagenz 10x (Roche)
mit TBS auf 1 L auffüllen
• Block.Stlsg B 5 g Casein (Fluka) / 100 ml PBS
• Blockierungslösung A 5 ml Blockierungs- Stammlösung A
45 ml TBS
• Blockierungslösung B 10 ml Blockierungs- Stammlösung B
20 ml TBS
• Detektionslösung AP 1,98 ml Detektionspuffer
20 µl CDP- Star - Lösung
• Detektionslösung POD 1,5 ml Substrat- Lösung A (5 mM Luminol, 5 mM 4-Jodphenol in
0,1 M Tris-HCl ,pH 9,35)
1,5 ml Substrat- Lösung B (100 µl/L Wasserstoffperoxid in
0,1 M Tris - HCl, pH 9,35)
• Detektionspuffer AP 0,1 M Tris-HCl
0,1 M NaCl
50 mM MgCl2
pH auf 9,5 eingestellt
• α- FLUOS POD- St.lsg. lyophilisiertes Anti – FLUOS - Fab- POD in 1ml Aqua bidest (250 U/ ml))
vor Gebrauch kurz abzentrifugieren
• α-FLUOS POD- Arb.lsg. 1,25 ml Blockierungsreagenz- Stammlösung
23,75 ml TBS
10 µl Anti- FLUOS- POD- Stammlösung