Protein ? Disassembly im Verlauf der endosomalen Prozessierung

Material und Methoden Seite 43
ein heterogenes Phasensystem, das aus einer flüssigen und einer festen Phase, der Gel-
matrix, besteht. Die Gelmatrix besteht aus porösen Kügelchen, die aus unlöslichen, aber
stark hydratisierten Polymeren wie Dextran oder Agarose bestehen. Die Poren, welche
mit der flüssigen Phase gefüllt sind, haben eine Größe, die vergleichbar ist mit der Grö-
ße der zu trennenden Moleküle. Relativ kleine Moleküle können in die Poren diffundie-
ren, wogegen relativ große Moleküle aufgrund ihrer Größe nicht im gleichen Maße in die
Poren diffundieren können. Sehr große Moleküle können überhaupt nicht in die Poren
diffundieren und bleiben in der flüssigen Phase, dem Ausschlußvolumen der Säule.
Große Moleküle passieren die Säule schneller und verlassen sie zuerst, weil ihnen ein
kleineres Volumen zugänglich ist. Kleinere Moleküle werden länger zurückgehalten, ihre
Retentionszeit ist um so größer, je kleiner sie sind. Die Reihenfolge des Austritts von
Molekülen ist umgekehrt zur Reihenfolge bei der Elektrophorese. Bei der Gelfiltration
wird nicht die Molekülmasse, sondern die Größe in Form des Stoke´schen Radius des
Moleküls bestimmt [101 a - c].
Für die Auflösung der Trennung ist das verwendete Säulenmaterial (u.a. Porengröße),
Länge der Säule, aufgetragenes Probenvolumen und Flußrate von Bedeutung. So ist die
Auflösung proportional zur Quadratwurzel der Säulenlänge, aber auch die Elutionszeit
ist proportional der Säulenlänge. Da die Separation nur von der Größe der Moleküle ab-
hängt, ist die Zusammensetzung des Eluents für die Trennung nicht von Bedeutung.
Üblicherweise wird ein Puffer verwendet, der einen definierten pH und Ionenzusammen-
setzung besitzt, bei dem die Struktur und biologische Funktion der zu trennenden Mole-
küle erhalten bleibt. Eine Ionenstärke größer als 0,15 ist generell zu empfehlen, um un-
erwünschte ionische Wechselwirkungen zwischen den gelösten Molekülen und der Gel-
matrix zu verhindern.
2.4.2 Prinzip der Ionenaustausch- Chromatographie
Ionenaustausch- Chromatographie (IEX) trennt Moleküle nach ihrer Nettoladung. Nega-
tiv oder positiv geladene Gruppen werden kovalent an eine Matrix gekoppelt, wodurch
man Kationen- respektive Anionenaustauscher erhält. Moleküle mit entgegengesetzter
Ladung werden vom Ionentauscher gebunden, während neutrale und gleich geladene im
Ausschlußvolumen der Säule eluieren. Die Bindung der geladenen Moleküle ist reversi-
bel und adsorbierte Moleküle werden gewöhnlich mit einem Salz- oder pH- Gradienten
eluiert. Die Wahl der Ionentauscher Matrix ist abhängig von den Eigenschaften des zu