Protein ? Disassembly im Verlauf der endosomalen Prozessierung

Material und Methoden Seite 52
2.7 Molekulargenetische Arbeiten
2.7.1 Isolierung von Gesamt- RNA aus eukaryontischen Zellen
Bei allen Arbeiten mit RNA muß besonders die Kontamination mit RNA- degradierenden
Enzymen, den Ribonukleasen, vermieden werden. Diese ubiquitären und äußerst robus-
ten Enzyme zeichnen sich durch extreme Thermostabilität und Unempfindlichkeit gegen
chemische Agenzien der verschiedensten Stoffklassen aus. Da diese Enzyme bereits in
geringen Mengen wirksam sind, wurden folgende Vorsichtsmaßnahmen getroffen:
• Bei allen Arbeiten wurden Handschuhe getragen
• Glas- und Plastikwaren wurden vor Gebrauch autoklaviert
• Wenn möglich wurden die Lösungen zur Inaktivierung von RNasen mit DEPC behandelt und autoklaviert
• Es wurde nur DEPC- behandeltes Aqua bidest. (DEPC-H2O) verwendet
• RNA- Präparationen wurden stets bei –70°C gelagert
• Alle Lösungen wurden sterilfiltriert
2.7.1.1 Einfrieren von Zellen für RNA- Präparationen
Die für die RNA- Isolierung vorgesehenen Zellen wurden geerntet und einmal mit PBS
gewaschen. Von dem erhaltenen Zellsediment wurde verbleibende Waschflüßigkeit mög-
lichst weitgehend entfernt. Die Zellen wurden anschließend in flüssigem Stickstoff bei –
196°C schockgefroren und bis zur weiteren Aufarbeitung bei –70°C gelagert.
2.7.1.2 Präparation der RNA
• GSCN-Stammlösung 59,1 g GSCN
950 mg Na-Citrat
625 mg Sarcosyl
ad 100 ml DEPC-H2O
• GSCN/ME 976 µl GSCN- Stammlösung
24 µl 2-Mercaptoethanol
• NaAc-Lsg. 3M Natriumacetat, pH 8,0
• Phenol/Chloroform Lsg. 25 ml Phenol
24 ml Chloroform
1 ml Isoamylalkohol
• DEPC/EtOH 5 µl DEPC
45 µl 99,9% Ethanol
• NP40-Lyse- Stammlsg. 0,5 ml 2 M Tris
2,8 ml 5 M NaCl
1,5 ml 1 M MgCl2
0,5 ml NP40