Protein ? Disassembly im Verlauf der endosomalen Prozessierung
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Material und Methoden Seite 49<br />
wurden bei 10.000g zentrifugiert und anschließend durch ein 0,2µm Filter sterilfiltriert.<br />
Zudem wurde die Probe vorher in den Laufpuffer A umdialysiert.<br />
2.4.5.2 Durchführung <strong>der</strong> Anionenaustauschchromatographie<br />
Das Motorventil MV – 7 wurde mit dem 10 ml Superloop verbunden, <strong>der</strong> Monitor UV-1<br />
mit <strong>der</strong> optischen Einheit für 280 nm verbunden und die OD auf 0,2 bzw. 2,0 einge-<br />
stellt. Das Ventil wurde auf Position I. gestellt und <strong>der</strong> Superloop mit Hilfe <strong>der</strong> Peristal-<br />
tikpumpe gefüllt. Nach Anschluß <strong>der</strong> Säule wurde das Schaltprogramm in Tab. 6 ge-<br />
startet und das Monitorsignal auf dem Schreiber mitprotokolliert.<br />
2.5 Enzymatische Verdauung <strong>der</strong> Modellproteine in vitro<br />
Um Degradierungsfragmente <strong>der</strong> Modellantigene durch die Proteasen Kathepsin B und<br />
D zu ermitteln, wurden verschiedene Testsysteme etabliert. Sie ermöglichen den Nach-<br />
weis <strong>der</strong> Fragmente sowohl <strong>der</strong> markierten als auch <strong>der</strong> unmarkierten Modellantigene;<br />
die unmarkierten <strong>Protein</strong>e können sowohl in <strong>der</strong> SDS-PAGE als auch mittels Gelfiltrati-<br />
on getrennt werden.<br />
Zeit Zeit Befehl Wert Kommentar<br />
POROS MonoQ<br />
0,0 0,0 CONC %B 0,0 Nur Puffer A<br />
0,0 0,0 ML / MIN 4,00 Flußrate auf 4 ml/min<br />
0,0 0,0 CM / MIN 0,50 Schreibergeschwindigkeit<br />
0,0 0,0 VALVE.POS 1,1 Ventil auf Pos. I.<br />
0,0 0,0 CLEAR DATA Internen Speicher löschen<br />
0,0 0,0 MONITOR 1 PEAK Monitor 1 (UV-1)<br />
0,0 0,0 LEVEL % 10 Peaks ab 10% Vollauschlag<br />
0,0 0,0 INTEGRATE 1 Int. Peakintegrator ein<br />
0,0 0,0 PORT.SET 6.1 Fraktionssammler ein<br />
2,0 2,0 CONC %B 0,0<br />
2,0 2,0 CONC %B 100 Nur Elutionspuffer, Säule waschen<br />
4,0 14,0 CONC %B 0,0<br />
10,0 24,0 ML / MIN 1,0 Flußrate für Probenauftrag<br />
10,0 24,0 VALVE.POS 1,2 Probenauftrag<br />
10,0 24,0 MIN / MARK 1,0 Internen Schreiber ein<br />
11,0 25,0 VALVE.POS 1,1 Ende Probenauftrag, hier 1 ml<br />
11,0 25,0 ML / MIN 4,0 Normale Flußrate<br />
13,0 35,0 CONC %B 0 Start Gradient<br />
33,0 285,0 CONC %B 100 Gradient in 100 CV<br />
33,0 285,0 PORT.SET 6.0 Fraktionssammler aus<br />
33,0 285,0 CONC %B 0 Nur Auftragspuffer<br />
40,0 300,0 CONC %B 0 Säule waschen<br />
Tab. 6 Schaltprogramm für die Anionenaustauschchromatographie
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