Protein ? Disassembly im Verlauf der endosomalen Prozessierung

Diskussion Seite 141
pelten – Sekundärantikörper nachgewiesen wird, zeigte die bereits bekannte Kreuzreak-
tivität der verwendeten Sekundärantikörper. Des weiteren hatten die monoklonalen an-
ti-FITC Antikörper im Western Blot nur eine geringe Affinität zu dem FITC – Marker.
Der direkte Nachweis über Fluoreszenzaktivierung der FITC - Gruppen hatte dagegen
zahlreiche Vorteile. Da nur das zugesetzte Modellprotein über Fluoreszenzgruppen ver-
fügt, ist jede Kreuzreaktivität durch Antikörper ausgeschlossen. Die Banden sind zudem
bei einer präparativen Präparation auch mit dem Auge sichtbar, so dass sie für eine Se-
quenzierung aus der Membran leicht ausgeschnitten werden können.
Die Stärke der Fluoreszenz zeigte jedoch eine Abhängigkeit von der verwendeten PVDF –
Membran. Verschiedene Chargen an PVDF – Membranen zeigten einen unterschiedlich
starken Hintergrund beim Nachweis. Teilweise konnte nur ein sehr schwacher Kontrast
erreicht werden. Zudem ist der Nachweis sehr empfindlich gegen Staubpartikel, da diese
im UV-Licht stark emittieren. Die verwendeten Lösungen beim Transfer der separierten
Proteine auf die PVDF – Membran sowie die Waschlösungen müssen mit sehr reinem
H2O partikelfrei angesetzt werden. Eine weitere Limitation war durch die verwendete
CCD – Kamera gegeben. Diese verfügt nur über eine geringe Auflösung von 640x480
Punkten bei 256 Graustufen. Hier wäre eine hochauflösende CCD – Optik mit mindes-
tens 1024x768 Pixel bei 16 Millionen Farben von Vorteil. Eine farbige CCD – Optik wür-
de es zudem ermöglichen, die grüne Fluoreszenz des angeregten FITC herausfiltern zu
können. Damit könnte der Hintergrund vollständig eliminiert werden. Des weiteren zeigt
der Nachweis keine so starken Überstrahlungen [156].
4.1.2 Trennung der komplexen Zellsolubilisate in der Gelelektrophorese
Das verwendete Elektrophoresesystem hat einen erheblichen Einfluss auf die Trennung
von komplexen Proteingemischen [156]. Für die hochauflösende eindimensionale Gele-
lektrophorese ist eine akribische Probenvorbereitung notwendig, um die maximale Auf-
lösung zu erhalten. Das Laemmli – Elektrophorese System [92a] zeigte sich für die ange-
strebten Untersuchungen als ungeeignet [121], da das System bei der Auftrennung von
Zellsolubilisaten eine schlechte Trennung im Bereich von 1-50 kD aufwies. Die nachzu-
weisenden Peptide der in vivo Prozessierung lagen in diesem Molekulargewichtsbereich.
Das Schägger – Jagow Elektrophoresesystem basiert auf dem Leition Tricin und einem
diskontinuierlichen Puffersystem [93]. Das Tricin Gelsystem zeigt einige Vorteile gegen-
über dem Laemmli – System. Die Separation von Proteinen im Molekulargewichtsbereich