Protein ? Disassembly im Verlauf der endosomalen Prozessierung

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OVA Grade VII [121]. Somit wurde gewährleistet, dass es sich um dasselbe Protein han-
delt. In einem nächsten Lauf wurde die präparative Reinigung an der POROS HQ/F-
Säule untersucht. Für die verwendete Säule ist ein maximales Bindevermögen von ca.
40 mg Protein angegeben. Da ein Großteil der Verunreinigungen von OVA Grade II nicht
an die Matrix bindet, wurden 50 mg Ausgangsmaterial eingesetzt. Der präparative An-
satz zeigte einige Unterschiede zum analytischen Lauf. Zum einen eluiert das Material
früher als beim analytischen Lauf, zum anderen wird ein breiter Elutionspeak erhalten.
Eine Konzentrationsbestimmung ergab, dass ca. 12 mg Protein von der Säule eluiert
werden konnten. Dies entspricht ungefähr 25% des Ausgangsmaterials.
Um das Material näher zu charakterisieren, wurde von dem Säuleneluat eine Gelfiltrati-
on an Superose 12 durchgeführt (Abb. 10-C). Hierfür wurden 12,5 µg eingesetzt, um ei-
nen Vergleich mit den in der Diplomarbeit [121] gewonnen Daten zu ermöglichen. Im
Gegensatz zu OVA Grade VII zeigt das gereinigte Protein neben dem bekannten Haupt-
peak bei 26,6 Min. Retentionszeit einen weiteren Peak, der früher eluiert. SDS-Page
Analysen konnten jedoch keinen Unterschied der beiden Peaks aufzeigen, so dass es
sich beim ersten Peak vermutlich um eine stärker manosylierte Form des Ovalbumins
handelt. Ausgehend von diesen Daten wurde eine präparative Reinigung von einem
Gramm OVA Grade II an einer Mono Q- Matrix durchgeführt. Das erhaltene Chroma-
togramm ähnelt dem an der POROS HQ/F erhaltenen Ergebnis. Der frühere Elutions-
zeitpunkt ist mit der unterschiedlichen Matrix zu erklären.
SDS-PAGE Analysen zeigen die hohe Reinheit des eluierten Materials. Unterschiede im
Aufreinigungsvermögen der POROS HQ/F und der Mono Q- Matrix konnten nicht fest-
gestellt werden. Die Abb. 11-A zeigt die silbergefärbten Eluate der Anionenaustauschch-
romatographie. Obwohl in den Spuren 2-5 eine hohe Probenkonzentration eingesetzt
wurde, zeigt sich dennoch die hohe Reinheit des OVA - Proteins gegenüber dem Aus-
gangsmaterials in Spur 1. Die Bandenunschärfe ist auf die hohen Salzkonzentration der
Proben nach der Anionenaustausch – Chromatographie sowie der Manosylierung von
OVA zurückzuführen. Zudem kommt es unter diesen Bedingungen zu Artefakten beim
Nachweis der Proteine durch Silberfärbung [156]. Verdünnt man die Proben, so zeigt
sich eine nahezu 100%ige Reinheit des OVA – Proteins (Spur 6 und 7). Gegenüber dem
käuflich erworbenen Material (Spur 8) zeigen sich keine Abbauprodukte. In der Abb. 11-
B wurden die beiden Peak - Eluate der Gelfiltration weiter untersucht. Hierbei zeigte
sich, dass beide Peak - Eluate ein identisches Molekulargewicht aufwiesen, obwohl sie