Protein ? Disassembly im Verlauf der endosomalen Prozessierung

Ergebnisse Seite 77
3.1.5 Molekularbiologische Untersuchungen
Das Prozessierungsverhalten von Makrophagen kann durch den Einfluss von Zytokinen
wie γ - Interferon oder bakteriellen Stoffen wie LPS vielfältig beeinflusst werden. Eine
Möglichkeit besteht darin, dass durch die Aktivierung der Makrophagen das Expressi-
onsmuster der lysosomalen Proteinasen verändert wird. Dies würde einen direkten Ein-
fluss auf die Prozessierung von Proteinantigenen zeigen. Daher wurde das Expressions-
muster der wichtigsten Proteinasen untersucht. Der Nachweis wurde mittels RT-PCR
durchgeführt. Diese Methode zeigt gegenüber den traditionellen proteinchemischen
Nachweismethoden den Vorteil der hohen Reproduzierbarkeit und Empfindlichkeit.
3.1.5.1 RNA – Isolation aus Knochenmarks - Makrophagen
In einem ersten Schritt wurde aus unstimulierten sowie LPS- bzw. γ -Interferonstimu-
lierten Makrophagen RNA isoliert. Um zu überprüfen, ob die gewonne RNA intakt ist,
wurde diese gelelektrophoretische in einem Agarose – Gel aufgetrennt und mit Ethidi-
umbromid angefärbt.
Abb. 15 Integritätsprüfung der isolierten RNA
Jeweils 3µl der frisch isolierten RNA wurden
gelelektrophoretisch aufgetrennt und mit Ethidiumbromid
angefärbt.
1: unstimulierte M∅; 2: γ-INF stimulierte M∅; 3: LPS
stimulierte M∅
Wie die Abb. 15 zeigt, ist die RNA bei allen drei Aktivierungszuständen intakt. Dies zeigt
zudem, dass die Zellen durch die Stimulierung nicht apoptotisch geworden sind. Apop-
totische Zellen beginnen mit dem vollständigen Abbau ihrer Nukleinsäuren [122], so
dass mittels dieses Testes die Vitalität von Zellen überprüft werden kann. Dabei muss
aber darauf geachtet werden, dass extrem sauber gearbeitet wird, da nicht inaktivierte