Protein ? Disassembly im Verlauf der endosomalen Prozessierung

Material und Methoden Seite 29
2.3.2 Eindimensionale SDS - Polyacrylamid Gelelektrophorese
Bei der 1D-SDS-Page werden Proteine unter denaturierenden Bedingen nach ihrem Mo-
lekulargewicht aufgetrennt. Durch die Bindung von Natriumdodecylsulfat (SDS ,H3C-
(CH2)10-CH2OSO3 - Na +) werden die Proteine denaturiert, da SDS alle nicht kovalenten
Wechselwirkungen in nativen Proteinen zerstört. Die SDS - Anionen binden sich an die
Hauptketten, etwa ein SDS - Molekül pro zwei Aminosäurereste, so dass ein Komplex
aus denaturiertem Protein und SDS entsteht. Die stark negative Ladung des Proteins ist
dank seiner Masse proportional. Die erworbene negative Ladung ist zumeist wesentlich
größer als die ursprüngliche Ladung des Proteins, so dass seine Ladung vernachlässigt
werden kann. Somit hängt die Wanderungsgeschwindigkeit nur noch von der Moleku-
largröße bzw. der Anzahl SDS - vermittelter Ladungen und der Porengröße des Gels ab.
Des weiteren ist die elektrophoretische Beweglichkeit vieler Proteine in SDS - Polyacry-
lamidgelen dem Logarithmus ihrer Masse proportional [92 a - f].
Um im niedermolekularen Bereich zwischen 1-100 kD eine bessere Auftrennung zu er-
halten, wurde zusätzlich zum Glycin – System nach Lämmli das Tricin – System einge-
setzt. Dieses wird durch den Einsatz des Leitions Tricin und ein diskontinuierliches Puf-
fersystem erreicht [93].
2.3.2.1 Materialien und Lösungen
• Flachgelkammern, Anfertigung nach Institutserfordernissen (Keuz, Reiskirchen)
• 2 Glasplatten 165 * 150 mm, eine mit einem Ausschnitt von 120*20 mm an der schmalen Seite
• Abstandshalter (Spacer) aus Kunststoff (170 * 12 mm; 1,5 mm oder 1,0 mm dick)
• Probenkamm, Teflon, 120 mm breit, 12 Probentaschen à 100µl
• Metallklammern (Roth, Karlsruhe)
• Vaseline (Roth, Karlsruhe)
• Elektrodenpuffer Glycin 4x 60 g Tris
288 g Glycin
100 ml SDS 20% (20 g)
ad 5 l, eingestellt auf pH 8,5
• Anodenpuffer Tricin 0,2 M Tris (24,23 g/l)
ad 1 l, mit konz. HCl auf pH 8,9 eingestellt
• Kathodenpuffer Tricin 0,1 M Tris (12,11 g/l)
0,1 M Tricin (17,92 g/l)
0,1 M SDS (5 ml 20 % SDS-Lsg. / 1000 ml)
ad 1 l, pH beträgt 8,25
• Lösung A 3 M (366 g/l) Tris
48 % (v/v) 1 N HCl (480 ml/l)
eingestellt auf pH 8,5
• Lösung B 3,0 M Tris (36,34 g/ 100 ml)