Protein ? Disassembly im Verlauf der endosomalen Prozessierung

Ergebnisse Seite 95
3.1.12 Zweidimensionale Analyse der Antigenprozessierung durch unstimulierte
Makrophagen
Um nachzuweisen, ob die Proteinaseinhibitoren Pepstatin A und Leupeptin einen quali-
tativen Einfluss auf die Prozessierung des Proteinantigens FITC-OVA zeigen, wurden
zweidimensionale Gelelektrophoresen durchgeführt.
Hierbei wird als zweiter Trennparameter der isoelektrische Punkt des Proteins/ Peptids
ausgenutzt, an dem die elektrische Mobilität annähernd Null ist. Aufgrund der be-
schränkten Ladekapazität der Rundgele konnte nur die halbe Probenmenge gegenüber
der SDS – PAGE aufgetragen werden. Zudem konnte die Probe nicht abzentrifugiert wer-
den, da trotz 8M Harnstoff im Probenpuffer die Abbaufragmente ausfielen. Dieses führte
zu einer Beeinflussung des Laufverhaltens in der ersten Dimension. Zusätzlich musste
aufgrund dieser technischen Einschränkungen sehr lange belichtet werden. Dadurch
kam es zu erheblichen Überstrahlungen, die Auswertung nahezu unmöglich machten.
Wie bereits bei der 2D – Analyse der in vitro Verdauung (Kapitel 3.1.4) zeigt sich die
starke Heterogenität des FITC – OVA in der zweidimensionalen Analyse. Eine reprodu-
zierbare zweidimensionale Trennung der in Makrophagen generierten FITC-OVA Frag-
mente konnte jedoch nicht bewerkstelligt werden. So sind die einzelnen Peaks so
schwach, das sie nicht klar nachweisbar sind. Schwache Fluoreszenz ist bei 40 kD und
einem pI von 5,3 nachweisbar, ebenso ist ein sehr schwacher Peak bei ca. 30 kD und
einem pI von 4,5 sichtbar. Für diese Peaks musste aber bereits extrem lange belichtet
werden, so dass der FIITC-OVA Peak mit einem Molekulargewicht von 50 kD stark über-
strahlte. Auch hier ist ein schlechtes Laufverhalten des FITC – OVA in der zweidimensi-
onalen Elektrophorese zu beobachten. Aufgrund der technischen Beschränkungen des
O´Farrell 2-D Elektrophorese Systems konnte auch nicht eine größere Probenmenge
aufgetragen werden. Aufgrund der extrem schwachen Signale und der schlechten Do-
kumentationsmöglichkeit der Daten wurde auf weitergehende Experimente verzichtet.
3.1.13 Prozessierung von FITC – OVA durch dendritische Zellen
Dendritische Zellen spielen eine zentrale Rolle bei der Initierung der erworbenen Im-
munantwort. Daher war es von Interesse, die Antigenprozessierung von FITC-OVA in
dendritischen Zellen zu untersuchen. Zudem stand ein effizientes Kultursystem für diese
ZellenzurVerfügung[86].DasichjedochentgegenderMakrophagen–Kulturnurweni-
ge dendritische Zellen in hoher Reinheit gewinnen lassen, wurde für den Versuch nur