Protein ? Disassembly im Verlauf der endosomalen Prozessierung
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Material und Methoden Seite 56<br />
2.7.3.1 cDNA – Synthese mit dem ThermoScript RT-PCR System<br />
• ThermoScript RT 15 U/µl (Gibco)<br />
• 5x cDNA Synthesepuffer 250 mM Tris<br />
375 mM Kaliumacetat<br />
40 mM Magnesiumacetat<br />
pH 8,4<br />
• DTT-Lsg. 0,1 M DTT<br />
• dNTP- Mix 10mM<br />
• RNaseOut 40 U/µl<br />
• Oligo (dT)20 50 µM<br />
• DEPC – H2O<br />
• cDNA Synthesemix 4 µl 5x cDNA Synthesepuffer<br />
1µl0,1MDTT<br />
2µl10mMdNTPs<br />
1µlDEPC–H2O<br />
1 µl RNaseOut<br />
1 µl ThermoScript RT<br />
Das ThermoScript RT-PCR System ist für die sensitive und reproduzierbare Detektion<br />
und Analyse von RNA – Molekülen in einem Zwei - Stufen Prozess von <strong>der</strong> Firma Gibco<br />
entwickelt worden. Dieses System dient <strong>der</strong> Erststrang – cDNA - Synthese aus PolyA -<br />
mRNA o<strong>der</strong> gesamtzellulärer RNA. Die hierbei verwendete AMV - ThermoScript RNase H -<br />
RT zeichnet sich durch eine erhöhte Temperaturstabilität aus. Daher führt sie zu höhe-<br />
ren cDNA - Ausbeuten und zu mehr full - length cDNA Transkripten als herkömmliche<br />
Reverse Transkriptasen. Das System ist so ausgerichtet, dass sogar noch 10pg zelluläre<br />
RNA für eine Erststrang – cDNA - Synthese ausreichen.<br />
In sterilen 1,5ml Eppendorf - Caps wurden jeweils etwa 1-2µg DNase - behandelte, ge-<br />
samtzelluläre RNA mit 50µM Oligo(dT) - Pr<strong>im</strong>er o<strong>der</strong> 10mM Ankerpr<strong>im</strong>er zusammenge-<br />
geben und mit DEPC-H2O auf 10µl aufgefüllt. Dann wurden die Ansätze bei 65°C für<br />
5min denaturiert und anschließend auf Eis gestellt. Daraufhin wurden je 10µl einer Re-<br />
aktionsmischung (für n Proben galt: (n+1) x (4µl 5x cDNA - Synthese-Puffer, 2µl dNTP -<br />
Mix, 1µl DTT, 1µl RNaseOUT, 1µl DEPC-H2O, 1µl ThermoScript RT)) auf Eis zu den ein-<br />
zelnen Ansätzen gegeben. Die einzelnen Proben wurden daraufhin 30-60min für die<br />
cDNA - Synthese in vorgewärmte Wasserbä<strong>der</strong> gegeben. Dabei galt für den Oligo(dT)20<br />
und die Ankerpr<strong>im</strong>er eine Wasserbadtemperatur von 50-60°C und für die genspezifi-<br />
schen Pr<strong>im</strong>er eine Temperatur je nach Schmelzpunkt des verwendeten Pr<strong>im</strong>ers von bis<br />
zu 65°C. Anschließend wurde die Reaktion für 5min bei 85°C gestoppt. . Dann wurden<br />
die Proben auf Eis gestellt und kurz abzentrifugiert. Zu den Proben wurde dann 1µl
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