Protein ? Disassembly im Verlauf der endosomalen Prozessierung

Diskussion Seite 150
Um die beteiligten Proteinasen weiter einzuengen, wurden weitere Proteinase – Inhibito-
ren eingesetzt. Nach jeweils vierstündiger Inkubation wurden der Abbau von FITC – OVA
untersucht. Dabei zeigte sich, dass einzig Pepstatin A in sehr hoher Konzentration den
Abbau von FITC – OVA teilweise inhibieren konnte. In diesem Fall entstand ein Frag-
ment mit einem Molekulargewicht von 45 kD. Alle anderen Proteinase – Inhibitoren, vor
allem die SH – Inhibitoren konnten den Abbau von FITC – OVA auch in sehr hohen Kon-
zentrationen nicht inhibieren. Für den initialen Schnitt von FITC – OVA scheint eine
saure Proteinase verantwortlich zu sein, die sich nur in hohen Dosen von Pepstatin A
inhibieren lässt. Der Inhibitionsversuch legte eine zweistufigen Abbauprozess mit
schnell aufeinander folgenden Schnitten nahe. Eine weitere Eingrenzung der am Abbau
von FITC – OVA beteiligten Proteinasen wurde durch die Edmann – Sequenzierung des
40 kD – Fragmentes versucht.
4.2.5 Sequenzierung des intrazellulär generierten FITC-OVA 40 kD – Fragmentes
Die N – terminale Sequenzierung des 40 kD – Fragmentes erbrachte Hinweise dafür,
dass der proteolytische Abbau von FITC – OVA in zwei schnell aufeinander folgenden
Schritten erfolgt. Das Zwischenprodukt mit einem Molekulargewicht von 45 kD ist nur
durch die Inhibition einer Pepstatin A sensitiven Proteinase zugänglich. Es kann jedoch
ausgehend von der Sequenz nicht entschieden werden, welcher der beiden Schnitte der
erste ist.
Die Sequenzierung ergab, dass eines der dominanten RT1.Bl OVA – Epitope, das OVA323-
339 als eines der ersten Peptide im Verlauf der Prozessierung von Ovalbumin gebildet
wird. Das gebildete Fragment ist größer als das an RT1.B l gebundene OVA - Peptid
[183]. Das abgespaltene Peptid ab Aminosäureposition 300 bindet vermutlich im ganzen
an das RT1.B l – Molekül und wird möglicherweise terminal von Exopeptidasen getrimmt
[36]. Dabei bleibt das Core – Peptid in der Bindungsgrube des RT1.B l –Molekülserhal-
ten. Das OVA323-339 Peptid ist als hochaffin – bindendes Peptid für RT1.B l beschrieben
worden [184].
Die Sequenzierung erbrachte keinen Aufschluss über die an der Prozessierung beteilig-
ten Proteinasen. Ein Vergleich der Schnittsequenz mit der Substratspezifität von be-
kannten endo-/lysosomalen Proteinasen erbrachte keinerlei Übereinstimmung. Es ist
davon auszugehen, dass eine Proteinase mit noch nicht bekannter Spezifität für die pro-
teolytische Spaltung verantwortlich ist. Ein potentieller Kandidat ist die Proteinase Le-