Protein ? Disassembly im Verlauf der endosomalen Prozessierung
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Ergebnisse Seite 81<br />
ren Versuche sichergestellt, dass das prozessierte FITC-OVA aus den Zellen stammt und<br />
nicht durch evtl. <strong>im</strong> Medium vorhandene <strong>Protein</strong>asen gespalten wurde.<br />
3.1.7 Solubilisierungsbedingungen für FITC-OVA gepulste Zellen und<br />
Trennbedingungen für die Zellsolubilisate<br />
Für die weiteren Versuche war es notwendig, die Bedingungen des Zellaufschlusses zu<br />
untersuchen. Da be<strong>im</strong> Zellaufschluss zahlreiche intrazelluläre <strong>Protein</strong>asen freigesetzt<br />
werden, ist es nötig <strong>Protein</strong>aseinhibitoren einzusetzen. Als Aufschlussmethode bietet<br />
sich bei eukaryontischen Zellen neben mechanischem Aufschluss die Solubilisierung<br />
durch Detergentien an. Letztere Methode ist bereits in unserem Labor etabliert und in-<br />
terferiert nicht mit nachfolgenden Analysemethoden. Neben <strong>der</strong> Wahl des Detergens ist<br />
auch die eingesetzte Zellzahl wichtig. Diese sollte in Hinblick auf Versuche mit dendriti-<br />
schen Zellen möglichst gering sein, da sich diese Zellen nur schwer in großer Zellzahl<br />
und Reinheit gewinnen lassen. Um auszuschließen, dass während <strong>der</strong> Solubilisierung<br />
freiwerdende <strong>Protein</strong>asen das <strong>Protein</strong>antigen abbauen, wurden zwei verschiedene Inhibi-<br />
toren – Cocktails eingesetzt. Die min<strong>im</strong>al einzusetzende <strong>Protein</strong>menge wurde bereits in<br />
Vorarbeiten [121] ausgetestet. Für die Versuche wurden Knochenmarkszellen nach dem<br />
Standardprotokoll mit M-CSF für 11 Tage kultiviert. An Tag 11 wurden unterschiedliche<br />
Zellzahlen mit 25µg FITC – OVA für 4h inkubiert. Nach Ablauf <strong>der</strong> Inkubationszeit wur-<br />
den die Zellen nach unterschiedlichen Protokollen solubilisiert. Die Zellsolubilisate wur-<br />
den in <strong>der</strong> SDS-PAGE aufgetrennt und <strong>der</strong> Nachweis <strong>der</strong> FITC - markierten Fragmente<br />
erfolgte durch Aktivierung <strong>der</strong> Fluoreszenz mittels UV-Licht. Um zweid<strong>im</strong>ensionale Gela-<br />
nalysen durchführen zu können, wurden nichtionische Detergentien eingesetzt.<br />
Wie die Abb. 17 A zeigt, ist es mit dem nichtionischen Detergens Nonident P40 nicht<br />
möglich, Abbaufragmente bei den gewählten Zellzahlen nachzuweisen. Zudem zeigt sich,<br />
dass nur eine geringe Menge des Ausgangsmaterial nachweisbar ist. Erkennbar ist, das<br />
die Menge des eingesetzten Ausgangsmaterials mit zunehmen<strong>der</strong> Zellzahl abn<strong>im</strong>mt. Das<br />
Detergens Nonident P40 zeigte sich als nicht geeignet, um eine genügende Menge von<br />
FITC – OVA Fragmenten in Lösung zu halten.
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