Protein ? Disassembly im Verlauf der endosomalen Prozessierung
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Ergebnisse Seite 91<br />
ist nach einem fünfzigminütigem Pulse sichtbar. Dieses FITC-OVA Fragment zeigt ein<br />
Signalmax<strong>im</strong>um nach einer zweistündigen Inkubation.<br />
3.1.11 Einfluß verschiedener <strong>Protein</strong>aseinhibitoren auf die Antigenprozessierung<br />
Um die an <strong>der</strong> Antigenprozessierung beteiligten <strong>Protein</strong>asen näher charakterisieren zu<br />
können, wurden weitere Inhibitoren eingesetzt. Die endo - / lysosomalen <strong>Protein</strong>asen<br />
lassen sich nach <strong>der</strong> reaktiven Gruppe <strong>im</strong> Zentrum des Enzyms in zwei Untergruppen<br />
unterteilen: Thiol (SH)- <strong>Protein</strong>asen, die einen Cysteinrest <strong>im</strong> aktiven Zentrum tragen<br />
und Aspartat (saure) – <strong>Protein</strong>asen, bei denen die Carboxygruppen von Asparaginsäure-<br />
Resten an <strong>der</strong> Katalyse beteiligt sind. Serin- <strong>Protein</strong>asen sind zytosolische <strong>Protein</strong>asen,<br />
Metalloproteinasen sind dagegen hauptsächlich an <strong>der</strong> Zelloberfläche zu finden[125].<br />
Die letztgenannten Gruppen sind vermutlich nicht an <strong>der</strong> MHC Klasse II restringierten<br />
Antigenprozessierung beteiligt.<br />
Für die Hemmung von Aspartat – <strong>Protein</strong>asen steht zur Zeit lediglich <strong>der</strong> bereits einge-<br />
setzte Inhibitor Pepstatin A zur Verfügung. Dieses ist darauf zurückzuführen, dass die<br />
sauren <strong>Protein</strong>asen aufgrund ihres Wirkmechanismus extrem pH – empfindlich sind. Bei<br />
pH - Werten über pH 7,0 sind die Aspartat- <strong>Protein</strong>asen inaktiv [123]. Um auch solche<br />
saure <strong>Protein</strong>asen hemmen zu können, die sich von Pepstatin A nur in sehr hohen Kon-<br />
zentrationen inhibieren lassen, wurde eine fünffach höhere Konzentration eingesetzt.<br />
Hierbei zeigten sich jedoch bereits toxische Auswirkungen auf die Zellen; die Zellvitalität<br />
nahm nach 20h Inkubation um bis zu 30% ab.<br />
Zusätzlich zum SH – <strong>Protein</strong>aseinhibitor Leupeptin wurde <strong>der</strong> Inhibitor E-64d eingesetzt,<br />
<strong>der</strong> die gesamte Familie <strong>der</strong> Calpaine und Papaine inhibiert. Auch hier wurden unter-<br />
schiedliche Dosen eingesetzt, da für diesen Inhibitor eine eingeschränkte Zellmembran-<br />
permeabilität beschrieben wurde [128]. Um die beteiligten <strong>Protein</strong>asen weiter einschrän-<br />
ken zu können, wurde zusätzlich <strong>der</strong> spezifische Kathepsin Inhibitor CAT3 eingesetzt.<br />
Dieser Inhibitor ist selektiv gegen die Kathepsin- <strong>Protein</strong>asen B,L und S gerichtet. Auch<br />
dieser Inhibitor wurde in unterschiedlichen Dosen eingesetzt.<br />
Bei allen Versuchen wurde <strong>der</strong> Inhibitor sechzehn Stunden vor Antigengabe zugesetzt,<br />
um zu gewährleisten, dass <strong>der</strong> Inhibitor die intrazellulären <strong>Protein</strong>asen inhibierte. Das<br />
<strong>Protein</strong>antigen wurde für vier Stunden zugegeben. Die Kinetikexper<strong>im</strong>ente zeigten, dass<br />
zu diesem Zeitpunkt unabhängig vom Aktivierungszustand <strong>der</strong> Knochenmarks-