Protein ? Disassembly im Verlauf der endosomalen Prozessierung

Material und Methoden Seite 38
• Transferpuffer 48 mM (5,82 g/l) TRIS
39 mM (2,94 g/l) Glycin [99]
2.3.6.2 Durchführung
Zur Vorbereitung des Western Blots wurde die Blotkammer mit Transferpuffer gefüllt
und bei 4°C vorgekühlt. Das Polyacrylamid - Gel wurde nach vorsichtigem Abheben der
Glasplatten für 15- 25 min in Transferpuffer equilibriert; während dieses Schrittes wur-
de das Gel mit Hilfe eines Skalpells auf die benötigte Größe geschnitten. Die PVDF -
Membran wurde auf Gelgröße zurechtgeschnitten, wobei darauf geachtet wurde, die
Membran nicht mit ungeschützten Fingern zu berühren. Vier Filterpapiere wurden für
Abb. 6 Schematischer Aufbau der Transfer-Apperatur
1 = Gelhalter, 2 = Gel, 3 = Membran, 4 Filterpapier, 5 Puffertank
das Blotten auf Gelgröße zusammengeschnitten und vor dem Blotten in Transferpuffer
inkubiert. Die PVDF - Membran wurde kurz in p.a. Methanol angefeuchtet und für min-
destens 5 min. in Transferpuffer equilibriert. Die Schaumstoffunterlagen der Blothalte-
rung wurden nach gründlicher Reinigung mit Aqua bidest. in Transferpuffer befeuchtet
und die einzelnen Komponenten wie in Abb. 6 übereinander geschichtet, wobei genau