Protein ? Disassembly im Verlauf der endosomalen Prozessierung

Material und Methoden Seite 33
Halterung fixiert. Mittels einer Einwegspritze mit aufgesetzter Kanüle wurden die Röhr-
chen zu einer Höhe von exakt 11cm mit der vorbereiteten IEF-Gelmischung luftblasen-
frei gefüllt und mit Gelüberschichtungslösung aufgefüllt. Nach einer Polymerisationszeit
von einer Stunde wurden Parafilm und Gelüberschichtungslösung entfernt und die
Rundgele in die Elektrophoresekammer eingespannt. Dabei wurde darauf geachtet, das
sich am unteren Ende keine Luftblasen festsetzten. Bis zum Probenauftrag konnten die
Gele mit 20 µl Probenüberschichtungslösung versehen aufgehoben werden.
Für die zweite Dimension wurden Standard 10% Tricingele mit einer Dicke von 1mm ge-
gossen. Als Probenkamm diente ein spezieller IEF-Kamm mit einer 11 cm langen Tasche
für die Rundgele und einer Probentasche für den Molekulargewichtsstandard.
2.3.3.3 Durchführung der zweidimensionalen Elektrophorese
Die in maximal 80 µl IEF-Probenpuffer gelösten Proben wurden nach Zusatz von 5µl
IEF-Standard mit einer Mikroliterspritze blasenfrei unter die Probenüberschichtungslö-
sung gefüllt. Anschließend wurden zunächst die Glasröhrchen und dann der gesamte
Anodenraum mit Anodenpuffer aufgefüllt. Die isoelektrische Fokussierung erfolgte unter
schrittweiser Erhöhung der Spannung (30 min 100V, 30 min 200V, 16h 300V, 1h
800V). Der mitgeführte IEF-Standard fokussiert als charakteristische rotbraune Bande
am anodischen Ende des Rundgels und ermöglicht so die Kontrolle der Auftrennung.
Nach Beendigung der Fokussierung wurden die Glasröhrchen entnommen und bei –
20°C eingefroren.
Für die zweite Dimension wurde die Probentasche der vorbereiteten Flachgele gründlich
mit Aqua bidest. abgespült. Das tiefgeforene IEF-Rundgel wurde mit Druckluft vorsichtig
aus dem Glasröhrchen gepresst und horizontal auf den oberen Rand des Tricingels ge-
legt. Das IEF-Rundgel wurde mit einem Filterpapierstück von 1,5 cm x 11 cm fixiert.
Dabei wurde darauf geachtet, das sich an der Kontaktstelle zwischen Rundgel und
Flachgel keine Lufteinschlüsse befanden. Nach Einspannen des Gels in die Elektropho-
resekammer wurde der gesamte obere Gelrand mit SDS-Probenpuffer überschichtet.
Dabei diente das Filterpapier als Reservoir für den Probenpuffer. Anschließend wurde
die obere Kammer mit Elektrophoresepuffer aufgefüllt. Der Gellauf wurde unter Stan-
dardbedingungen durchgeführt.