Protein ? Disassembly im Verlauf der endosomalen Prozessierung
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Material und Methoden Seite 58<br />
Befehl Parameter Kommentar<br />
1 LIDHT 110°C Deckelheizung an<br />
2 TEMP 94°C, 3:30 min Denaturierung<br />
3 LIDOP Deckel auf, Hot Start<br />
4 LIDCL Deckel schließen<br />
5 LOOP[ 2X Schleifenkörper 2x<br />
6 TEMP 94°C, 0:45 min Denaturierung<br />
7 TEMP 67°C, 1:00 min Annealing<br />
8 TEMP 72°C, 1:15 min Elongation<br />
9 LOOP] Ende Schleife<br />
10 LOOP[ 2x Schleifenkörper 2x<br />
11 TEMP 94°C, 0:45 min Denaturierung<br />
12 TEMP 66°C, 1:00 min Touchdown PCR<br />
13 TEMP 72°C, 1:15 min Elongation<br />
14 LOOP] Schleifenende<br />
15 LOOP[ 25X 25x Zyklen<br />
16 TEMP 94°C, 0:45 min Denaturierung<br />
17 TEMP 65°C, 1:00 min Annealing<br />
18 TEMP 72°C, 1:15 min Elongation<br />
19 LOOP] Schleifenende<br />
20 TEMP 72°C, 5:15 min Verlängerung lange Frag.<br />
21 LIDHT OFF Deckelheizung aus<br />
22 RAMP 4°C, 3°C/s auf 4° abkühlen<br />
23 TEMP 4°C, Forever auf 4°C halten<br />
24 END Programmende<br />
Tab. 10a Schaltprogramm für die Aktin - PCR<br />
wird die Anlagerungstemperatur kontinuierlich von einem Wert oberhalb <strong>der</strong> zu erwarte-<br />
ten Tm auf einen Wert unter Tm abgesenkt. Dies erleichtert die opt<strong>im</strong>ale Hybridisierung<br />
des Ampl<strong>im</strong>ers mit dem Zielmolekül; das richtige Amplikon wird vermehrt und angerei-<br />
chert, bevor unerwünschte Produkte auftauchen.<br />
Für den Nachweis <strong>der</strong> Kathepsine wurde eine Standard – PCR durchgeführt. Hierbei<br />
wurde auf eine Opt<strong>im</strong>ierung <strong>der</strong> PCR verzichtet, um die RT-PCR unter standardisierten<br />
Befehl Parameter Kommentar<br />
1 LIDHT 110°C Deckelheizung an<br />
2 TEMP 94°C, 3:30 min Denaturierung<br />
3 LIDOP Deckel auf, Hot Start<br />
4 LIDCL Deckel schließen<br />
5 LOOP[ 35x Schleifenkörper 35x<br />
6 TEMP 94°C, 1:00 min Denaturierung<br />
7 TEMP 60°C, 1:30 min Annealing<br />
8 TEMP 72°C, 1:30 min Elongation<br />
9 LOOP] Ende Schleife<br />
10 TEMP 72°C, 10:00 min lange Fragmente<br />
11 LIDHT OFF Deckelheizung aus<br />
12 RAMP 4°C, 3°C/s auf 4°C abkühlen<br />
13 TEMP 4°C, Forever Temperatur halten<br />
14 END Programmende<br />
Tab. 10b Schaltprogramm für die Standard - PCR
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