Protein ? Disassembly im Verlauf der endosomalen Prozessierung

Material und Methoden Seite 57
RNase H hinzugegeben und für 20min bei 37°C im Wasserbad inkubiert. Daraufhin
wurden die Proben bis zur weiteren Verwendung bei –20°C gelagert.
2.7.3.2 Durchführung der PCR
• Taq DNA Polymerase 5 U/µl Amplitaq (Gibco)
• 10x PCR Puffer (Gibco)
• MgCl2-Lsg. 50 mM MgCl2 (Gibco)
• dNTP-Mix 10 mM (Gibco)
• Forward-Primer 10 µM
• Reverse-Primer 10 µM
• Matrizen - cDNA
• DEPC-H2O
• Thermocycler MWG Primus 25
Die Taq - Polymerase ist ein hitzestabiles Enzym aus Thermus aquaticus [108], dass am
Komponente µl
cDNA 2
Taq-Polymerase 0,5
10xPCR Puffer 5
50 mM MgCl2
1,5
10 mM dNTP-Mix 1
10 µM Forward Primer 1
10 µM Reverse Primer 1
DEPC- H2O 38
Tab. 9 PCR - Reaktionsansatz
häufigsten für die PCR eingesetzt wird. Die optimale Temperatur für die Taq – Polymera-
se liegt zwischen 70-80°C. Bei dieser Temperatur synthetisiert sie DNA mit einer Ge-
schwindigkeit von 35-100 Nucleotiden pro Sekunde. Die Taq – Polymerase gehört zu
den hochprozessiven DNA – Polymerasen. Der PCR – Reaktionsansatz wurde gemäß Tab.
9 in 0,5 ml PCR Reaktionsgefäßen zusammenpipettiert. Um Verunreinigungen zu ver-
meiden, wurden nur autoklavierte Reaktionsgefäße, Pipettenspitzen und steriles Wasser
verwendet. Um die Spezifität der Reaktion zu erhöhen, wurde eine sogenannte Hot Start
PCR durchgeführt. Dabei wird die Polymerase erst nach der erstmaligen Denaturierung
der DNA zugegeben. Für den Nachweis des ubiquitären Haushaltsprotein β- Aktinwurde
ein spezielles Profil verwendet. Das Schaltprogramm für den MWG – Zykler ist in Tab.
10a angegeben. Die Aktin - PCR ist eine Touchdown-PCR. Hierbei sind die Bedingungen
für die Zyklen so gewählt, dass im wesentlichen das gewünschte Amplikon gebildet wird
und nur wenig PCR - Artefakte und Primerdimere entstehen. Während der PCR - Zyklen