Protein ? Disassembly im Verlauf der endosomalen Prozessierung

Material und Methoden Seite 35
alle Banden ausreichend anfärbten. Um die Entwicklung zu stoppen, wurde die Ent-
wicklerlösung abgegossen und durch die Stopplösung ersetzt. Nach mindestens 20 min.
in der Stopplösung wurde das Gel dreimal für je 5 min. gewaschen und anschließend 1
h in der Präservierungslösung inkubiert. Die Gele wurden in Hybridisierungsbeutel ein-
geschweißt und konnten bei 4°C für mehrere Monate aufbewahrt werden.
2.3.5 Markierung von Proteinen mit Fluorescein oder Digoxigenin
Die gängigen Verfahren zur biochemischen Charakterisierung von Proteinen beinhalten
eine Markierung mit Radioisotopen wie z.B. 125Jod, gefolgt von deren gelelektrophoreti-
scher Auftrennung [96]. Der Nachweis der Proteine erfolgt durch Autoradiographie. Der
Einsatz von Fluorescein oder Digoxigenin als Markierungsreagenz ermöglicht jedoch al-
ternative, nichtradioaktive Möglichkeiten zur Identifizierung von Proteinen. Dabei wer-
den Proteine mit Fluorescein bzw. Digoxigenin in Form seines Hydroxysuccinimidesters
inkubiert; im wässrigen Milieu folgt eine spontane Hydrolyse des Moleküls und Fluores-
cein bzw. Digoxigenin wird über eine kovalente Bindung an die ε- Aminogruppe der Ly-
sinreste gekoppelt [97 a - b]. Der Nachweis der Proteine erfolgt nach Blotten auf eine
PVDF - Membran über eine hochsensitive Chemilumineszenzreaktion. Die Fluorescein -
Gruppe wir durch einen Antikörper, das in Form eines Peroxidase - Konjugates einge-
setzt wird, nachgewiesen. Digoxigenin markierte Proteine werden gleichfalls über eine
Chemilumineszenz nachgewiesen, hier bindet jedoch ein Fab´-Fragment eines gegen Di-
goxigenin gerichteten Antikörpers, an den alkalische Phosphatase gebunden ist. Die ge-
koppelten Enzyme setzen ein spezifisches Chemilumineszenz – Substrat um, wodurch
Photonen emittiert werden. Diese Lichtemission kann durch Schwärzung des Röntgen-
films nachgewiesen werden.
Zusätzlich zur Chemilumineszenz – Detektion kann die Fluorescein – Gruppe auch
durch Fluoreszenz – Aktivierung nachgewiesen werden. Durch Aktivierung mit kurzwel-
ligem Licht kommt es zu einer starken Lichtemission im sichtbaren Bereich.
Durch den Einsatz von Fluorescein und Digoxygenin als Markierungsreagenz können die
verfahrenstechnischen Komplikationen der radioaktiven Markierung umgangen werden,
ohne dass die Nachweisqualität merklich nachlässt. Des weiteren sind Lysine statistisch
weit häufiger in Proteinen vorhanden als Tyrosine, an den der radioaktive Marker ge-
koppelt wird. Hierdurch können nach einer enzymatischen Spaltung des markierten