Protein ? Disassembly im Verlauf der endosomalen Prozessierung

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Proteinasen inhibiert. Durch den Einsatz von EDTA werden zudem die Metalloproteasen
inhibiert. Für die weiteren Versuche wurde bei der Solubilisierung der Zellen stets der
Proteinase – Inhibitor Cocktail Complete eingesetzt. Zusammenfassend ergibt sich durch
den Einsatz des nichtionischen Detergens Triton X 100 mit dem Inhibitor- Cocktail
Complete der optimale Solubilisierungspuffer für die weiteren Versuche. Die optimale
Zellzahl liegt bei 1x10 6 Zellen.
Für die Trennung der Zellsolubilisate in der SDS – PAGE wurden Tricin – Gele eingesetzt
[93]. Diese boten gegenüber den herkömmlichen Glycin – Gelen nach Laemmli [92] den
Vorteil der höheren Auflösung im Molekulargewichtsbereich von 1-100 kD. Nachteilig ist
jedoch die geringere Schärfe der Banden. Zudem sind die Gele sehr empfindlich gegen-
über hohen Salzkonzentrationen im Probenpuffer. Für die Kinetikanalysen wurde der
direkte Fluoreszenz – Nachweis gewählt, da so densiometrische Auswertungen möglich
waren. Die verwendete CCD – Kamera verfügt über eine lineare Kennlinie, während
Röntgenfilme eine exponentielle Kennlinie haben. Da das vorhandene Imagingsystem je-
doch nur eine begrenzte Auflösung hat, wurde aus drucktechnischen Gründen bei den
Kinetikexperimenten auf eine Darstellung der SDS – Gele weitgehend verzichtet.
Diese ersten Experimente zeigten, dass mit dem gewählten Experimentalansatz in
KMM∅ generierte Abbaufragmente von FITC-OVA in der SDS – PAGE getrennt werden
können und durch Fluoreszenzaktivierung nachgewiesen werden können. Dabei zeigte
sich nach einem vierstündigen FITC-OVA Pulse bereits ein Abbaufragment mit einem
Molekulargewicht von 40 kD.
3.1.8 Kinetik der Antigenprozessierung durch Knochenmarksmakrophagen
Um ein grundlegendes Verständnis über die dynamischen Prozesse der Antigenprozes-
sierung zu erhalten, wurden Kinetikexperimente durchgeführt. Mit Hilfe dieser Experi-
mente sollte geklärt werden, in welchem Zeitraum das Modellantigen FITC - Ovalbumin
durch intrazelluläre Proteinasen degradiert wird. Durch diese Information könnte der
Ort der Prozessierung innerhalb des Endo-/lysosomalen Apparates angenähert werden.
Grundlegende Arbeiten über die Endozytose zeigten eine klare Korrelation zwischen dem
Aufenthalt in bestimmten intrazellulären Kompartimenten und der Zeit seit Aufnahme
des Antigens[125]. Zusätzlich wurde der Einfluss der Makrophagenaktivierung auf die
Prozessierung untersucht. Hierzu wurden die Knochenmarksmakrophagen einerseits mit
γ- Interferon, andererseits mit dem bakteriellen Oberflächenantigen LPS stimuliert.