Protein ? Disassembly im Verlauf der endosomalen Prozessierung

Material und Methoden Seite 28
in 20mM Tris, 1mM EDTA, pH 8,5
Um bei der Zelllyse die Proteine nicht zu denaturieren, ist es sinnvoll, ein nichtionisches
Detergens wie Nonident P40 oder Triton X 100 einzusetzen. Ein weitere Vorteil ist, dass -
im Gegensatz zur SDS - Lyse- auch zweidimensionale Analysen möglich sind.
Nach dem Ernten der Zellen und zweimaligen Waschen wurde zum Zellpellet der Solubi-
lisierungspuffer gegeben. Nach einer halbstündigen Inkubation konnten die Proben wei-
teren Untersuchungen zugeführt werden.
2.3 Elektrophoretische Methoden
2.3.1 Allgemeines
Eine sehr leistungsfähige Methode zur Auftrennung von Proteinen beruht auf dem Phä-
nomen, dass ein Molekül mit einer Nettoladung im elektrischen Feld wandert. Diesen
Vorgang bezeichnet man als Elektrophorese, wobei die Wanderungsgeschwindigkeit des
Proteins (bzw. eines anderen Moleküls) im elektrischen Feld abhängig von der elektri-
schen Feldstärke (E), der Nettoladung des Proteins (z) und dem Reibungskoeffizienten (f)
ist. Es gilt :
V = Ez
f
Um eine bessere Auftrennung zu ermöglichen, führt man die elektrophoretische Auf-
trennung nicht in wässriger Lösung, sondern in einer Matrix durch. Hierdurch werden
durch kleine Temperaturgradienten verursachte Konvektionsströme vermieden; ferner
wirken sie als Molekularsiebe und verbessern so die Auflösung. Moleküle, die im Ver-
hältnis zu den Gelporen kleiner sind, wandern rasch vorwärts, im Verhältnis größere
bleiben nahezu unbeweglich; Moleküle mittlerer Größe wandern mit entsprechender Ge-
schwindigkeit durch das Gel. Als Trägermedium werden bei der Elektrophorese häufig
Polyacrylamidgele verwendet, da diese chemisch inert und durch Polymerisation von Ac-
rylamid leicht herzustellen sind. Die Porengröße kann durch unterschiedliche Konzent-
rationen von Acrylamid und Methylenbisacrylamid, einem quervernetzenden Reagens
variiert werden [91].