Protein ? Disassembly im Verlauf der endosomalen Prozessierung

Diskussion Seite 142
zwischen 1-100 kD kann mit einem 10% Gel bei einer niedrigen Konzentration an
Crosslinker erreicht werden. Auf die Herstellung von Gradientengelen kann verzichtet
werden, ein Vorteil für den Nachweis im Gel oder beim Elektroblotting. Zudem zeigt sich
das Tricin - System im Gegensatz zum Laemmli – System weniger störanfällig bei hohen
Probenmengen und Salzkonzentrationen des Probenpuffers.
Im Vergleich zu Glycin – Gelen nach Laemmli sind bei den Tricin – Gelen jedoch un-
schärfere Banden in Kauf zu nehmen. Zudem liegen die Banden unterschiedlichen Mo-
lekulargewichts abhängig von der Ionenstärke des Probenpuffers verschieden weit aus-
einander. Bei sehr hohen Ionenstärken wie bei den Proben für die Edmann – Sequenzie-
rung liegen die Banden sehr nahe beieinander. Außerdem dauert die Trennung der Pro-
teingemische im Tricin – System wesentlich länger und es sind höhere Stromstärken
erforderlich.
Die zweidimensionale Trennung (erste Dimension IEF, zweite Dimension SDS – PAGE)
komplexer Zellsolubilisate nach O´Farrell erwies sich als nahezu unmöglich. Ein Groß-
teil der Proteine blieb bei der Auftrennung in den Rundgelen am oberen Rand der Rund-
gele hängen und wurde daher während der IEF nicht getrennt. Dies ist auf das komple-
xe Zellsolubilisat zurückzuführen. Möglicherweise verhindern Teile der Zellmembran das
Eindringen der Proteine in die Gelmatrix. Ein Abzentrifugieren der Proben vor der Sepa-
ration war nicht möglich, da ein Großteil der markierten Proteine und Proteinfragmente
wegen ihres hydrophoben Charakters zusammen mit Zellwandbruchstücken ausfiel.
Möglicherweise gibt es starke hydrophobe Wechselwirkungen des FITC – Markers mit
den lipophilen Bestandteilen der Zellmembran. Die beschränkte Ladekapazität der
Rundgele verhinderte zudem den Auftrag einer genügenden Probenmenge.
Um die eindimensionale Auftrennung der FITC – markierten Proteinfragmente und deren
Nachweis bei geringsten Mengen zu verbessern sind andere Techniken vielversprechend.
Chromatographische Verfahren wie die „High Performance Size Exclusion Chroma-
tographie (HPSEC)“ mit einem Detektor kombiniert mit einer Fluoreszensaktivierungs –
Einheit konnten von anderen Arbeitsgruppen erfolgreich für den Nachweis geringster
Proteinmengen eingesetzt werden [157]. Auch der Einsatz der Kapillar – Elektrophorese
könnte die Trennung und den Nachweis verbessern. Für zweidimensionale Trennungen
sei hier auf das IPG – System verwiesen [158] .