Protein ? Disassembly im Verlauf der endosomalen Prozessierung

Ergebnisse Seite 74
Abb. 13 Enzymatische in vitro Verdauung von FITCmarkiertem
Ovalbumin
Es wurden 1µg FITC-OVA mit 1µg Kathepsin B und/oder 1µg Kathepsin D für 4h bei
37°C in einem Endvolumen von 40µl enzymatisch verdaut. Nach Ablauf der
Reaktionszeit wurden die Proben kurz abzentrifugiert, mit Laemmli- Puffer versetzt und in
der 1D-SDS- PAGE aufgetrennt. Der Nachweis erfolgte durch Fluoreszenz- Aktivierung.
A= FITC-OVA, B= FITC-OVA + KAT B, C= FITC-OVA+KAT D, D= FITC-OVA+KAT D+B
bei pH 5,9. A´,B´,C´,D´ bei pH 4,6.
Der Verdau von FITC- Ovalbumin mit den Proteinasen Kathepsin B und D zeigt das be-
reits aus der Diplomarbeit bekannte Abbaumuster, welches auch mit DIG- und Biotin -
markiertem Ovalbumin erhalten wurde [121]. Unterschiede in den Molekulargewichten
der erhaltenen Banden lassen sich mit dem unterschiedlichen Molekulargewicht des
Markierungsrestes erklären.
3.1.4 2D – Analyse von enzymatisch abgebauten FITC- Ovalbumin
Um vergleichen zu können, ob das in den Zellen verdaute Ovalbumin die gleichen Frag-
mente ergibt wie das in vitro enzymatisch abgebaute Molekül, wurden die Ansätze zwei-
dimensional aufgetrennt (Abb. 14 A-D). Hierdurch wird neben dem Molekulargewicht
der isoelektrische Punkt als zweiter Messparameter eingeführt. Diese hochauflösende
Methode erleichtert die Identifikation von gleichen Peptiden mittels Gelelektrophorese.