Protein ? Disassembly im Verlauf der endosomalen Prozessierung

Ergebnisse Seite 82
Als weiteres nichtionisches Detergens wurde Triton X 100 eingesetzt. Bei der Solubilisie-
rung mit Triton X 100 zeigt sich eine deutlich stärkere Bande des Ausgangsmaterials ge-
genüber der Solubilisierung mit Nonident P40 (Abb. 17 B). Abbaufragmente sind jedoch
auch hier erst bei einer Zellzahl von 1x10 6 Zellen nachweisbar . Bei dendritischen Zellen
Abb. 17 Einfluß der Detergentien und der Zellzahl auf den Nachweis
von in vivo prozessierten Fragmenten von FITC-OVA
Zu unstimulierten KMM∅ wurde pro Well 25 µg FITC-OVA für 4h gegeben. Nach zweimaligem
Waschen wurden die Zellen mit dem entsprechenden Detergens solubilisiert. Die Trennung der
Fragmente erfolgte in der SDS-PAGE mit 10% Tricin-Gelen. Der Nachweis erfolgte durch
Fluoreszenzaktivierung und Aufnahme der Signale mit einer CCD-Kamera.
A: Solubilisierung mit 1% nichtionischen Detergens Nonident P40
B: Solubilisierung mit 1% nichtionischem Detergens Triton X 100
1+2: 1x10 4 Zellen, 3+4 1x10 5 Zellen, 5+6 1x10 6 Zellen
1,3,5 :CBZ-Phe-Ala+Pepstatin als Inhibitor-Cocktail bei der Zell-Solubilisierung
2,4,6: Complete – Inhibitorset bei der Zell-Solubilisierung
konnte jedoch eine untere Zellgrenze von 5x10 5 Zellen festgestellt werden (siehe Kap.
3.1.13). Auffällig war zudem, dass bei der Solubilisierung mit Triton X 100 auch die
hochmolekularen Aggregate von Ovalbumin nachgewiesen werden.
Ein Einfluss der unterschiedlichen Inhibitor- Cocktails (CBZ-PHE-ALA/Pepsatin A bzw.
Complete) konnte nicht nachgewiesen werden. Beide Inhibitoren wurden in so hohen
Konzentrationen eingesetzt, das eine Aktivität der freigesetzten Proteinasen unwahr-
scheinlich ist. Zudem werden durch den basischen pH von 8,5 die meisten lysosomalen