Protein ? Disassembly im Verlauf der endosomalen Prozessierung

Material und Methoden Seite 27
2.2.7 Gewinnung von Knochenmarksmakrophagen
Unter dem Einfluss von M-CSF differenzieren und proliferieren Knochenmarkszellen zu
Makrophagen. Zur Generierung von Ratten - Makrophagen aus Knochenmarkspräpera-
tionen wurden 5 x 10 5 KM - Zellen/ml Kulturmedium (DMEM, 50 % L929-
Kulturüberstand, 5% FCS, 10 % HS, 1% Gln) in unbeschichte Petrischalen eingesät. Um
ein optimales Zellwachstum zu erreichen, wurden am fünften Tag 10 ml frisches Medi-
um pro Kulturschale zugegeben. Nach 9-11 Tagen Kulturdauer wurden die Zellen mit
Versen vom Boden der Petrischalen abgelöst [89].
2.2.8 Solubilisierung von Zellen
Um in Zellen aufgenommenes Antigen biochemisch untersuchen zu können, ist es not-
wendig, die Zellen zu solubilisieren. Hierzu stehen verschiedene Möglichkeiten zur Ver-
fügung: die Solubilisierung mit Detergentien oder durch Scherkräfte. Als Detergentien
stehen sowohl ionische als auch nichtionische zur Verfügung. Bei der Zellsolubilisierung
muss darauf geachtet werden, dass eine genügende Menge an Proteaseinhibitoren an-
wesend ist, um die intrazellulären Proteasen vollständig zu hemmen [90].
2.2.8.1 Solubilisierung mit ionischem Detergens
• Solubilisierungspuffer 1% SDS
16mM CBZ-Phe-Ala, 10mM Pepstatin A
oder eine Tablete Complete / 50 ml
in 20mM Tris, 1mM EDTA, pH 8,5
Für manche Proteine ist es nützlich, die Zellen unter denaturierenden Bedingungen zu
solubilisieren. Da eine Auftrennung der Proteine in der 1D-SDS-PAGE erfolgt, bietet sich
SDS als Detergens an.
Nach dem Ernten der Zellen wurde zweimal gewaschen und der Überstand durch Solu-
bilisierungspuffer ersetzt. Nach einer dreißigminütigen Inkubation bei Raumtemperatur
auf einem Schüttler konnten die Proben untersucht werden.
2.2.8.2 Solubilisierung mit nichtionischem Detergens
• Solubilisierungspuffer 1% Triton X 100 oder 1% Nonident P40
16mM CBZ-Phe-Ala, 10mM Pepstatin A
oder eine Tablete Complete / 50 ml