Protein ? Disassembly im Verlauf der endosomalen Prozessierung

Material und Methoden Seite 48
2.4.4.3 Regeneration der Säule
Um die Trenneigenschaften der Säule zu erhalten, ist ein regelmäßiges Waschen der
Säule notwendig; nach ca. 30-40 Chromatographieläufen ist zusätzlich ein Filterwechsel
notwendig.
Zur Reinigung wurde die Säule zuerst mit 50 ml 70% Essigsäure gewaschen, dabei wur-
de eine Flußrate von 0,2 ml / min eingestellt. Die Essigsäure wurde durch 50 ml 20%
Ethanol ersetzt. Im nachfolgenden Schritt wurde der pH mit 0,1 M NaOH neutralisiert
und im abschließenden Schritt die Säule mit Aqua bidest. gewaschen. Die Säule konnte
nun mit dem benötigten Puffer equilibriert werden.
Wurde die Trenneffizienz der Säule durch den Waschvorgang nicht wieder hergestellt,
wurde zusätzlich der obere Filter der Säule nach Herstellerangaben gewechselt.
2.4.5 Anionenausch- Chromatographie mit POROS HQ/F und MonoQ HR10/10
Die analytische Säule POROS HQ/F ist ein Polystyren / Divinylbenzen Medium, das für
die Perfusionschromatographie optimiert ist. Bei der Perfusionschromatographie enthal-
ten die Matrixpartikel zusätzliche Kanäle, die es der Flüssigkeit erlauben, auch durch
die Beads zu fließen. Dadurch wird die erforderliche Distanz für die Diffusion der Bio-
moleküle zu und von internen Bindungsseiten gegenüber der konventionellen Chroma-
tographie verkürzt. Hierdurch werden hohe Flußraten ohne Verlust der Bindungskapazi-
tät und Auflösung ermöglicht. Damit kann die benötigte Zeit für einen Lauf drastisch
verkürzt werden, was vor allem für analytische Trennungen von Vorteil ist [104] . Die
präparative Säule MonoQ HR 10/10 ist ein quervernetztes, hydrophiles Polyetherresin,
an das quatäre Ammoniumgruppen gekoppelt sind. Die MonoQ ist gegenüber der PO-
ROS HQ/F Säule ein klassisches Medium. Beide sind starke Anionenaustauscher und
zeigen eine ähnliche Trennleistung. Die mit der POROS HQ/F Säule ermittelten Gradien-
ten konnten leicht auf die präparative Säule übertragen werden, wenn man den Gra-
dienteninSäulenvolummen(CV)berechnete.
2.4.5.1 Proben und Puffervorbereitung
Um optimale Ergebnisse zu erhalten, wurden die Probe und die Puffer sorgfältig vorbe-
reitet. Alle verwendeten Puffer wurden sterilfiltriert und vollständig entgast. Die Proben