Protein ? Disassembly im Verlauf der endosomalen Prozessierung

Material und Methoden Seite 41
• Waschpuffer 0,1 % Tween 20 in Maleinsäurelsg (1ml Tween 20/ L TBS)
2.3.8.2 Nachweis von Fluorescein-markierten Proteinen
Zum direkten Nachweis über die Fluoreszenz wurde die gewaschene Membran in einem
Hybridisierungsbeutel eingeschweißt. Dabei wurde darauf geachtet, dass keine
Staubpartikel mit eingeschlossen wurden. Anschließend wurde die eingeschweißte
Membran auf einen UV-Tisch gelegt und mit UV-Licht der Wellenlänge 302 nm angeregt.
Die emittierte Fluoreszenz wurde mit dem Photo - Imaging System aufgezeichnet und
digital gespeichert. Danach konnte die Membran für den indirekten Nachweis weiter
verarbeitet werden. Dazu wurde die Membran wieder aus dem Hybridisierungsbeutel
herausgenommen.
Die Inkubationsschritte fanden alle auf einem Taumler bei mäßiger Geschwindigkeit
und Raumtemperatur statt. Die in TBS gewaschene Membran wurde 30 min. in Blockie-
rungslösung A inkubiert, anschließend wurde die Blockierungslösung verworfen. Im
nächsten Schritt wurde die Membran 45 min. mit α- FLUOS- POD- Arbeitslösung inku-
biert. Das ungebundene α- FLUOS- POD wurde nach der Inkubation durch viermaliges
Waschen (je 10 min.) in 100 ml Waschpuffer entfernt. Während dieser Schritte wurden
Substrat - Lösung A und B in einem Wasserbad bei 25°C auf Raumtemperatur gebracht
und 30 Minuten vor der Nachweisreaktion die Detektionslösung angesetzt. Die gewa-
schene PVDF - Membran wurde in einem Hybridisierungsbeutel von drei Seiten einge-
schweißt, die überflüssige Flüssigkeit mit einer Glaspipette durch Rollen auf einer wei-
chen Unterlage hinausgedrückt, das Detektionsreagens vorsichtig eingefüllt, gleichmä-
ßig mit der Glaspipette verteilt und nach Entfernen des überschüssigen Detektionsrea-
gens zugeschweißt. Die Inkubation mit dem Röntgenfilm erfolgte im Fotolabor unter ge-
eignetem Schutzlicht in einer Röntgenfilmkassette. Die Expositionsdauer variierte in Ab-
hängigkeit von der Signalstärke zwischen 0,5 s und 1 h, wobei die Röntgenfilme sofort
entwickelt wurden.
2.3.8.3 Nachweis von Digoxygenin-markierten Proteinen
Der Nachweis von Digoxygenin - markierten Proteinen erfolgt durch den Umsatz von
CDP - Star durch die alkalische Phsophatase. CDP - Star ist ein ultrasensitives Chlor-
substituiertes 1,2 - Dioxetan Chemilumineszenz - Substrat für die alkalische Phospha-
tase und führt zur schnellen Produktion von sichtbarem Licht. Die enzymatische