Protein ? Disassembly im Verlauf der endosomalen Prozessierung

Material und Methoden Seite 32
nung nach zwei Parametern erreicht, wodurch unterschiedliche Proteine mit gleichem
Molekulargewicht unterschieden werden können. Bei der isoelektrischen Fokussierung
(IEF) bildet eine in einer Acrylamidgelmatrix enthaltene Mischung niedermolekularer
Trägerampholyte nach Anlegen einer Spannung einen stabilen pH- Gradienten aus, in
dem sich die amphoteren Proteine nach Erreichen ihres isoelektrischen Punktes in en-
gen stationären Banden konzentrieren. Als Trennprinzip wird die Tatsache ausgenutzt,
dass die Mobilität der Proteine an ihrem isoelektrischen Punkt annähernd null ist.
2.3.3.1 Materialien und Lösungen
• IEF Elektrophoresekammer Typ 155 (Bio Rad, München)
• Glasröhrchen 150 mm lang, 1,5 mm Innendurchmesser (Bio Rad, München)
• Ampholines pH 3,5-10 (40% -ige Lösung; Fluka)
• Kanüle 180 mm lang, 22 Gauche (Fluka)
• Einwegspritze 5 ml (Bekton - Dickesson)
• IEF - Standard 2 mg/ml Cytochrom C in IEF Probenpuffer
• IEF - Probenpuffer 9,5 M Harnstoff
2% w/v Triton X 100
2% v/v Ampholines pH 3,5-10
Aqua bidest.
• IEF-Acrylamidlsg. 28,38% w/vAcrylamid
1,62% w/v N,N-Methylenbisacrylamid
Aqua bidest. ad 100%
• Triton X 100 Lsg. 10% w/v Triton X 100
• Gelüberschichtungslsg. 8 M Harnstoff
• Probenüberschichtungslsg. 1,75 M Harnstoff
1,25% Triton X 100
Aqua bidest. ad 100%
• Anodenpuffer 25 mM (3,33 g/l) Asparaginsäure
25 mM (3,68 g/l) Glutaminsäure
• Kathodenpuffer 570 mM (120 ml/l) Ethylendiamin
25 mM (4,35 g/l) Arginin
25 mM (3,65 g/l) Lysin
• IEF-Gelmischung 2,76g Harnstoff
1 ml Triton X 100 Lsg
0,66 ml IEF-Acrylamidlsg.
0,25 ml Ampholines
7 µl Temed
Aqua bidest. ad 5 ml
10 µl APS - Lösung (kurz vor dem Gießen hinzugeben)
2.3.3.2 Vorbereitungen
Alle Lösungen wurden vor Versuchsbeginn gründlich entgast. Die gründlich gesäuberten
Glasröhrchen wurden an einem Ende mit Parafilm verschlossen und vertikal in einer