Protein ? Disassembly im Verlauf der endosomalen Prozessierung
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Material und Methoden Seite 34<br />
2.3.4 Nachweis unmarkierter <strong>Protein</strong>e durch Silberfärbung<br />
Die Silberfärbung ist eine einfache und schnelle Methode, um in <strong>der</strong> SDS-PAGE aufge-<br />
trennte <strong>Protein</strong>e <strong>im</strong> Gel anzufärben. Die hohe Sensitivität dieser Visualisierungstechnik<br />
erlaubt die Detektion von <strong>Protein</strong>mengen bis in den Nanogramm - Bereich. Die Methode<br />
ist zuverlässig, reproduzierbar und ergibt einen niedrigen Hintergrund. Bei allen Ar-<br />
beitsschritten müssen Handschuhe getragen werden, da sich durch die hohe Nachweis-<br />
empfindlichkeit bereits Fingerabdrücke auf dem Gel anfärben [95].<br />
2.3.4.1 Reagenzien<br />
• Fixierlösung Ethanol 99,9% v/v (100 ml)<br />
Essigsäure 98% v/v (25 ml)<br />
mit Aqua bidest. auf 250 ml auffüllen<br />
• Sensitivierungslösung Ethanol 99,9% v/v (75 ml)<br />
Glutardialdehyd 25% w/v (1,25 ml)<br />
Natriumthiosulfat 5% w/v (10 ml)<br />
Natriumacetat (17 g)<br />
mit Aqua bidest. auf 250 ml auffüllen<br />
• Silberlösung Silbernitrat 2,5% w/v (25 ml)<br />
Formaldehyd 37% w/v (0,1 ml)<br />
mit Aqua bidest. auf 250 ml auffüllen<br />
• Entwicklerlösung Natriumcarbonat (6,25 g)<br />
Formaldehyd 37% w/v (0,05 ml)<br />
mit Aqua bidest. auf 250 ml auffüllen<br />
• Stopplösung EDTA-Na2*H2O (3,65 g) mit Aqua bidest. auf 250 ml auffüllen<br />
• Präservierungslösung Ethanol 99,9 % v/v (75 ml)<br />
Glycerin 98 % v/v (10,8 ml)<br />
mit Aqua bidest. auf 250 ml auffüllen<br />
2.3.4.2 Durchführung<br />
Nach Beendigung <strong>der</strong> Elektrophorese wurde das Gel für 30 min. in einer Stahlwanne mit<br />
Fixierlösung auf dem Taumler inkubiert; anschließend wurde die Lösung vorsichtig ab-<br />
gegossen und für weitere 30 min in <strong>der</strong> Sensitivierungslösung inkubiert. Nach Ab-<br />
schluss <strong>der</strong> Sensitivierung wurde die Lösung durch Aqua bidest. ersetzt und dre<strong>im</strong>al für<br />
je 5 min. gewaschen. Im Anschluss an den Waschvorgang wurde das Gel für 20 min in<br />
<strong>der</strong> Silberlösung inkubiert und danach zwe<strong>im</strong>al je eine Minute mit Aqua bidest. gewa-<br />
schen. Nun wurde die Entwicklerlösung zugesetzt und solange entwickelt, bis die Ban-<br />
den ausreichend sichtbar waren. Längere Entwicklungszeiten führten zu einer Erhöhung<br />
des Hintergrundes, während zu kurze Entwicklungszeiten dazu führten, dass sich nicht
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