Protein ? Disassembly im Verlauf der endosomalen Prozessierung

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Ergebnisse Seite 91 ist nach einem fünfzigminütigem Pulse sichtbar. Dieses FITC-OVA Fragment zeigt ein Signalmaximum nach einer zweistündigen Inkubation. 3.1.11 Einfluß verschiedener Proteinaseinhibitoren auf die Antigenprozessierung Um die an der Antigenprozessierung beteiligten Proteinasen näher charakterisieren zu können, wurden weitere Inhibitoren eingesetzt. Die endo - / lysosomalen Proteinasen lassen sich nach der reaktiven Gruppe im Zentrum des Enzyms in zwei Untergruppen unterteilen: Thiol (SH)- Proteinasen, die einen Cysteinrest im aktiven Zentrum tragen und Aspartat (saure) – Proteinasen, bei denen die Carboxygruppen von Asparaginsäure- Resten an der Katalyse beteiligt sind. Serin- Proteinasen sind zytosolische Proteinasen, Metalloproteinasen sind dagegen hauptsächlich an der Zelloberfläche zu finden[125]. Die letztgenannten Gruppen sind vermutlich nicht an der MHC Klasse II restringierten Antigenprozessierung beteiligt. Für die Hemmung von Aspartat – Proteinasen steht zur Zeit lediglich der bereits einge- setzte Inhibitor Pepstatin A zur Verfügung. Dieses ist darauf zurückzuführen, dass die sauren Proteinasen aufgrund ihres Wirkmechanismus extrem pH – empfindlich sind. Bei pH - Werten über pH 7,0 sind die Aspartat- Proteinasen inaktiv [123]. Um auch solche saure Proteinasen hemmen zu können, die sich von Pepstatin A nur in sehr hohen Kon- zentrationen inhibieren lassen, wurde eine fünffach höhere Konzentration eingesetzt. Hierbei zeigten sich jedoch bereits toxische Auswirkungen auf die Zellen; die Zellvitalität nahm nach 20h Inkubation um bis zu 30% ab. Zusätzlich zum SH – Proteinaseinhibitor Leupeptin wurde der Inhibitor E-64d eingesetzt, der die gesamte Familie der Calpaine und Papaine inhibiert. Auch hier wurden unter- schiedliche Dosen eingesetzt, da für diesen Inhibitor eine eingeschränkte Zellmembran- permeabilität beschrieben wurde [128]. Um die beteiligten Proteinasen weiter einschrän- ken zu können, wurde zusätzlich der spezifische Kathepsin Inhibitor CAT3 eingesetzt. Dieser Inhibitor ist selektiv gegen die Kathepsin- Proteinasen B,L und S gerichtet. Auch dieser Inhibitor wurde in unterschiedlichen Dosen eingesetzt. Bei allen Versuchen wurde der Inhibitor sechzehn Stunden vor Antigengabe zugesetzt, um zu gewährleisten, dass der Inhibitor die intrazellulären Proteinasen inhibierte. Das Proteinantigen wurde für vier Stunden zugegeben. Die Kinetikexperimente zeigten, dass zu diesem Zeitpunkt unabhängig vom Aktivierungszustand der Knochenmarks-
Ergebnisse Seite 92 makrophagen deutliche Abbauprodukte des FITC- Ovalbumins nachweisbar sind. Die Inhibitoren wurden während des Antigenpulses weiter zugegeben.
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