Protein ? Disassembly im Verlauf der endosomalen Prozessierung
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Diskussion Seite 143<br />
4.1.3 Solubilisierungsbedingungen <strong>der</strong> Modellantigen – gepulsten Zellen<br />
Einer <strong>der</strong> kritischen Punkte des Testsystems und ein entscheiden<strong>der</strong> Faktor für dessen<br />
Reproduzierbarkeit ist die Solubilisierung <strong>der</strong> antigengepulsten Zellen. Bei <strong>der</strong> Lyse <strong>der</strong><br />
Zellen ist darauf zu achten, dass freigesetzte zellulären <strong>Protein</strong>asen und Peptidasen in-<br />
aktiviert werden. Um diese Bedingung zu gewährleisten, wurde vor <strong>der</strong> Solubilisierung<br />
<strong>der</strong> Zellen ein komplexes Gemisch an Protease – Inhibitoren zugesetzt. Als zufriedenstel-<br />
lend erwies sich <strong>der</strong> Einsatz des Inhibitorgemisches Complete <strong>der</strong> Firma Roche. Hiermit<br />
wird durch die opt<strong>im</strong>al aufeinan<strong>der</strong> abgest<strong>im</strong>mte Kombination von Proteaseinhibitoren<br />
die vollständige Inaktivierung <strong>der</strong> Proteasen gewährleistet. Durch die Wahl des Lysepuf-<br />
fers mit einem pH von 8,0 und dem Zusatz von EDTA ist eine weitere Inhibition gewähr-<br />
leistet. Durch den hohen alkalischen pH ist die Reaktivität <strong>der</strong> sauren <strong>Protein</strong>asen wie<br />
Kathepsin D inhibiert; saure <strong>Protein</strong>asen sind nur bei einem pH kleiner als 7,0 aktiv.<br />
Das EDTA verhin<strong>der</strong>t durch Komplexierung von zweiwertigen Metallionen die Funktion<br />
<strong>der</strong> membranständigen Metalloproteinasen. Durch diese Wirkkombination ist sicherge-<br />
stellt, dass <strong>der</strong> Abbau des FITC markierten Modellproteins intrazellulär erfolgt und kein<br />
Solubilisierungsartefakt darstellt.<br />
Um Inkonsitenzen durch das Abernten und Umsetzen <strong>der</strong> Zellen zu verhin<strong>der</strong>n, wurde<br />
die Solubilisierung direkt in den 24 Well – Platten durchgeführt. Um störendes Serum-<br />
protein zu entfernen, wurden die Zellen vor <strong>der</strong> Lyse zwe<strong>im</strong>al mit PBS – gewaschen.<br />
Durch die hohe Adhärenz <strong>der</strong> Zellen an die beschichteten Kulturplatten konnte <strong>der</strong> Zell-<br />
verlust min<strong>im</strong>iert werden. Als min<strong>im</strong>ale Menge an Solubilisierungspuffer wurde 100µl<br />
verwendet. Für die Elektrophorese wurde jeweils 50µl des Solubilisates mit <strong>der</strong> gleichen<br />
Menge an SDS – Probenpuffer versetzt. Hierdurch konnte eine hohe Reproduzierbarkeit<br />
des Systems erreicht werden. Die beiden Parameter Zellzahl und Puffermenge konnten<br />
durch das eingesetzte System weitgehend konstant gehalten werden.
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