Protein ? Disassembly im Verlauf der endosomalen Prozessierung
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Material und Methoden Seite 47<br />
dium liegt in einer Pharmacia HR 10/30 Säule gepackt vor. Die Länge <strong>der</strong> Säule beträgt<br />
30 cm, und <strong>der</strong> innere Durchmesser 10 mm. Die Flußraten liegen zwischen 0,3 - 1,0<br />
ml/min bei einem max<strong>im</strong>alen Druck von 3 MPa. Das max<strong>im</strong>ale Probenvolumen liegt bei<br />
200 µl und sollte 30 mg/ml <strong>Protein</strong> nicht überschreiten.<br />
2.4.4.1 Proben- und Puffervorbereitung<br />
Um opt<strong>im</strong>ale Trennergebnisse zu erhalten, ist eine akribische Puffer- und Probenvorbe-<br />
reitung notwendig. Alle verwendeten Puffer wurden durch ein 0,2 µm Filter sterilfiltriert<br />
und in einer Saugflasche vollständig entgast. Die Proben wurden zunächst bei 10.000g<br />
für zehn Minuten abzentrifugiert und <strong>der</strong> Überstand durch ein 0,2 µm Filter filtriert. An-<br />
schließend wurde die Proben <strong>im</strong> Ultraschallbad für fünf Minuten entgast. Die so behan-<br />
delte Probe konnte nun mit Hilfe <strong>der</strong> Peristaltikpumpe P-1 in die Probenschleife einge-<br />
bracht werden.<br />
2.4.4.2 Durchführung <strong>der</strong> Gelfiltration<br />
Das Motorventil MV-7 wurde mit einer 50µl-Probenschleife versehen, <strong>der</strong> Monitor UV-1<br />
mit <strong>der</strong> Optischen Einheit für 214 nm verbunden und die OD auf 0,2 bzw. 0,5 AU ein-<br />
gestellt. Das Ventil wurde auf die Position I. gestellt und die Probenschleife mit Hilfe <strong>der</strong><br />
Peristaltikpumpe gefüllt. Nach Anschluß <strong>der</strong> Säule wurde das folgende Schaltprogramm<br />
gestartet und das Monitorsignal auf dem Schreiber mitprotokolliert.<br />
Zeit Befehl Wert Kommentar<br />
0,0 CONC %B 0,0 Nur Puffer A verwenden<br />
0,0 ML / MIN 0,5 Flußrate von 0,5 ml / min<br />
0,0 CM / MIN 0,5 Schreibervorschub 0,5 cm / min<br />
12,0 CLEAR DATA Internen Datenspeicher des Kontrollers löschen<br />
12,0 MONITOR 1 Peak Monitor 1 einstellen (UV-1)<br />
12,0 LEVEL % 10,0 Peaks ab 10% Vollausschlag auswerten<br />
12,0 MIN / MARK 1,0 Internen Druckervorschub auf 1 Markierung / min<br />
12,0 INTEGRATE 1 Internen Peakintegrator mit autom. Nullabgleich an<br />
12,0 VALVE.POS 1.2 Ventil auf Probenauftrag stellen<br />
28,0 VALVE.POS 1.1 Ventil auf Durchfluß stellen<br />
78,0 MONITOR 0 Monitor aus<br />
78,0 INTEGRATE 0 Peakintegrator aus und Werte ausdrucken<br />
Tab. 5 Schaltprogramm für die Gelfiltration mit Superose 12
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