Protein ? Disassembly im Verlauf der endosomalen Prozessierung
Protein ? Disassembly im Verlauf der endosomalen Prozessierung
Protein ? Disassembly im Verlauf der endosomalen Prozessierung
Sie wollen auch ein ePaper? Erhöhen Sie die Reichweite Ihrer Titel.
YUMPU macht aus Druck-PDFs automatisch weboptimierte ePaper, die Google liebt.
Material und Methoden Seite 25<br />
2.2.4.3 Best<strong>im</strong>mung <strong>der</strong> Zellzahl und <strong>der</strong> Zellvitalität<br />
Um die Lebendzellzahl zu best<strong>im</strong>men, wird eine Ausschlussfärbung mit Trypanblau<br />
durchgeführt. Die Zellmembran leben<strong>der</strong> Zellen ist für Trypanblau für ca. fünf bis sie-<br />
ben Minuten <strong>im</strong>permeabel, wogegen sich das Zytoplasma und <strong>der</strong> Zellkern toter Zellen<br />
sofort stark blau anfärben. Beschädigte Zellen, die kaum noch Zytoplasma enthalten,<br />
färben sich jedoch nur blaßblau. Die Zellen wurden nach <strong>der</strong> Zentrifugation in einem<br />
definiertem Volumen Medium aufgenommen, zum Zählen <strong>der</strong> Zellen in <strong>der</strong> Neubauer-<br />
Zählkammer wurde ein Aliquot dieser Zellsuspension mit Trypanblau nach Bedarf 1:2<br />
bis 1:64 verdünnt. Die Berechnung <strong>der</strong> Zellzahl erfolgte nach folgen<strong>der</strong> Formel:<br />
Zellzahl=(Z*V*X*10 4 )/Q<br />
Z = Zellzahl, V = Verdünnungsfaktor, 10 4 = Kammerfaktor, x = Gesamtvolumen <strong>der</strong> Zell-<br />
suspension in ml, Q = Anzahl <strong>der</strong> Eckquadrate<br />
2.2.5 Kryokonservierung und Rekultivierung von Zellen<br />
Um nicht alle Zellen auf Dauer in Kultur halten zu müssen, wurden Aliquote mit einer<br />
Zelldichte von 5x10 6 bis 1x10 7/ml FCS eingefroren und in flüssigem Stickstoff bei –<br />
196°C gelagert. Auf diese Weise können Zellen über Jahre aufbewahrt werden [84]. Um<br />
Zellschädigungen während des Einfrierens durch Scherkräfte <strong>der</strong> Wasserkristalle so ge-<br />
ring wie möglich zu halten, wurde den Zellsuspensionen kurz vor dem Einfrieren <strong>der</strong> Ge-<br />
frierschutz D<strong>im</strong>ethylsulfoxid (DMSO) in einer Endkonzentration von 10% zugesetzt. Die<br />
Zellsuspension wurde in Kryoampullen aliquotiert und bei –70°C eingefroren. Nach 24<br />
Stunden wurden die Zellaliquote in flüssigem Stickstoff eingelagert.<br />
Zur Rekultivierung wurden entsprechende Zellaliquote bei 37°C <strong>im</strong> Wasserbad aufgetaut<br />
und in 50 ml Kulturmedium überführt. Nach Kultur über Nacht wurden die Zellen ge-<br />
waschen und die Zellzahl best<strong>im</strong>mt. Nach erneutem Waschen zur vollständigen Entfer-<br />
nung des DMSO wurden die Zellen <strong>im</strong> entsprechenden Kulturmedium kultiviert.<br />
2.2.6 In vitro Generation von dendritischen Zellen<br />
Durch Anreicherung von dendritischen Zellen (DC) aus lymphatischen Organen kann<br />
aufgrund des geringen Vorkommens dieser Zellen in den Geweben und wegen aufwendi-<br />
ger Separationsverfahren nur eine geringe Menge an DC erhalten werden [85]. Die Etab-<br />
lierung eines in vitro Kultursystems in unserem Labor durch Fr. Dr. Mehlig ermöglicht
Change language