Protein ? Disassembly im Verlauf der endosomalen Prozessierung

Material und Methoden Seite 31
2.3.2.3 Vorbereitungen
An den nicht ausgeschnitten Seiten zwischen zwei Glasplatten wurden je drei Abstands-
halter positioniert, der Kontaktbereich zwischen Glasplatte und Abstandshalter durch
dünnes Auftragen von Vaseline abgedichtet und mit Hilfe von Metallklammern fixiert. In
den Hohlraum zwischen die Glasplatten konnten nun die Polyacrylamid - Gellösungen
gegossen werden. Nach Ansetzen der benötigten Menge an Gellösung wurde kurz vor
dem Gießen APS 10% als Starter der Polymerisierungsreaktion zugesetzt und die Lösung
gut durchmischt.
Nach Zugabe von APS - Lösung zur angesetzten Sammelgellösung wurde die Geltasche
gefüllt und der Probenkamm sorgfältig positioniert. Nach einer Polymerisationsdauer
von mindestens einer Stunde wurde der Probenkamm vorsichtig entfernt und die Ta-
schen mit Aqua bidest. gespült.
Vor dem Einsetzen des vorbereiteten Flachgels in die Elektrophoresekammer wurde der
untere Spacer entfernt und verbleibende Vaseline im entstandenen Spalt entfernt. Nun
wurden die Kammern mit Elektrophoresepuffer gefüllt und verbleibende Luft im Spalt
oder den Probentaschen mit Hilfe einer abgewinkelten Kanüle und einer Einwegspritze
entfernt, um eine gleichmäßige Ausbreitung des elektrischen Feldes zu ermöglichen.
2.3.2.4 Durchführung der Gelelektrophorese
Der Probenpuffer wurden mit 1ml Bromphenol - Blau versetzt, um zum einen eine visu-
elle Kontrolle beim Auftragen der Proben zu gewährleisten als auch den Fortgang der E-
lektrophorese beobachten zu können. Die Proben wurden mit Hilfe einer Hamiltonkanü-
le aufgetragen, dass maximale Endvolumen der Proben betrug 100 ml. Die Elektropho-
rese wurde bis zum Erreichen der Proben in das Trenngel bei 40 mA durchgeführt, an-
schließend wurde die Stromstärke auf 6 bis 8 mA bei Glycin -, bzw. auf 10-15 mA bei
Tricin- Gelen reduziert und das Gel über Nacht laufen gelassen. Die Elektrophorese
wurde beendet, wenn der Farbstoff den unteren Rand des Gels erreicht hatte.
2.3.3 Zweidimensionale Gelelektrophorese
Die zweidimensionale Gelelektrophorese nach O´Farrell [94] ist eine hochauflösende
Trennmethode für Proteine. Zusätzlich zur Trennung nach dem Molekulargewicht wird
eine Trennung nach dem isoelektrischen Punkt vorgeschaltet. Hierdurch wird eine Tren-