Protein ? Disassembly im Verlauf der endosomalen Prozessierung

Diskussion Seite 140
4.1 Technische Limitationen des in vivo Testsystems
Für die Untersuchung der intrazellulären Prozessierung von Proteinen ist es notwendig,
diese zu markieren. In Vorarbeiten wurde ein DIG – Marker [121] zur Markierung der
Proteine verwendet. Der Nachweis von DIG mit einer durch alkalische Phosphatase –
vermittelten Chemilumineszenzreaktion zeigte ein recht hohes, diffuses Hintergrundrau-
schen. Dies entsteht durch unspezifisches Binden des Nachweisantikörpers, an den die
alkalische Phosphatase gekoppelt ist, an die PVDF – Membran. Durch den hohen Hin-
tergrund lag die Nachweisgrenze bei ca. 100ng, was sich für die durchgeführten Versu-
che als zu niedrig erwies. Um die Nachweisgrenze zu erhöhen, wurde ein Primär – Se-
kundär Antikörper- Nachweissystem auf Basis der Peroxidase erprobt, das ebenfalls ei-
ne Chemilumineszenzreaktion auslöst. Durch die Verwendung eines Sekundärantikör-
pers wird im allgemeinen ein Verstärkungseffekt erreicht, da mehrere Sekundärantikör-
per am Primärantikörper binden können. Der verwendete Primärantikörper war eben-
falls ein polyklonaler α-DIG Schafsantikörper. Hierdurch konnte das markierte Ovalbu-
min bis in den Pikogrammbereich bei geringem Hintergrund nachgewiesen werden. Für
das in vivo Testsystem erwies sich dieses Nachweissystem als ungeeignet. So zeigten
sich die verwendeten Sekundärantikörper als extrem kreuzreaktiv. Nach längerer Belich-
tung konnten zahlreiche Zellproteine nachgewiesen werden. Daher wurde in dieser Ar-
beit ein weiterer Marker, FITC, eingeführt. Der Nachweis von FITC bot gegenüber dem
DIG – System einige Vorteile.
4.1.1 Nachweis der markierten Proteine
Ein Hauptproblem des Testsystems ist der Nachweis von geringen Proteinmengen im un-
teren Nanogrammbereich. Für den FITC – Marker gibt es zwei Nachweismöglichkeiten.
Neben dem antikörpervermittelten Chemilumineszenz - Nachweis kann der Farbstoff
FITC auch durch Fluoreszenzaktivierung nachgewiesen werden. Die Lichtemissionen des
angeregten FITC werden in diesem Fall mit einer CCD – Optik aufgenommen. Die kom-
merziell erhältlichen polyklonalen anti-FITC Antikörper zeigten zahlreiche Nachteile. Die
direkt mit einem Enzym gekoppelten Antikörper konnten das reine FITC – OVA im Wes-
tern Blot gut nachweisen, zeigten jedoch bei dem in vivo Testsystem zahlreiche unspezi-
fische Banden. Zudem war dabei die Hintergrundfärbung hoch. Der indirekte Nachweis
über einen monoklonalen anti FITC Primärantikörper, der durch einen an POD - gekop-