Protein ? Disassembly im Verlauf der endosomalen Prozessierung

Material und Methoden Seite 42
Dephosphorylierung von CDP - Star führt zur Bildung eines metastabilen Dioxetan Phe-
nolat - Anions, das beim Zerfall in gepufferter Lösung zu einer Lichtemmission bei 466
nm führt. Auf PVDF - Membranen wird die maximale Lichtemission nach ca. 3 h er-
reicht und bleibt bis zu 3 Tagen erhalten. Da bei der Detektion aufgrund der, im Ver-
gleich zum α- FLUOS- POD - System, höheren unspezifischen Bindung des anti – Dig -
AP - Fab´- Fragments an PVDF - Membranen, mußte mit BSA blockiert werden, um eine
deutliche Herabsetzung des Hintergrundes zu erreichen.
Nach dem Abbau des Blots wurde die Membran sofort für mindestens eine Stunde bei
Raumtemperatur im Blockierungspuffer inkubiert. Um eine noch weitere Herabsetzung
des Hintergrundes zu erreichen, wurde auch über Nacht bei 4°C blockiert. Nach erfolg-
ter Blockierung wurde das Reagens verworfen und durch Anti –Dig - AP- Arbeitslösung
ersetzt. Exakt eine halben Stunde später wurde viermal mindestens zehn Minuten im
Waschpuffer gewaschen, um nicht gebundenen Antikörper zu entfernen. Die Membran
wurde in einem Hybridisierungs - Beutel derartig eingeschweißt, dass eine Seite offen
blieb. Die CDP – Star - Detektionslösung wurde so in den Hybridisierungs - Beutel ein-
gefüllt, dass nur die Oberseite der Membran benetzt wurde. Durch Rollen mit einer
Glaspipette wurde die Lösung gleichmäßig über die Membran verteilt und überflüssiges
Reagens herausgerollt. Nach einer fünfminütigen Inkubation wurde das Detektionsrea-
gens vollständig herausgedrückt, der Beutel aufgeschnitten und die Membran in einem
neuen Hybridisierungsbeutel vollständig eingeschweißt. Hierdurch wurden unspezifi-
sche Signale durch Bindung des umgesetzten CDP – Star - Substrates an den Hybridi-
sierungsbeutel vermieden. Die eingeschweißte Membran wurde nun in einer Expositi-
onskassette fixiert und konnte nach ca. 15 Minuten auf einem Röntgenfilm exponiert
werden. Das Auflegen des Röntgenfilms erfolgte unter Schutzlicht. Durch eine Verände-
rung des Expositionszeit konnte die Signalstärke variert werden, typische Expositions-
zeiten lagen zwischen wenigen Sekunden bis zu eineinhalb Stunden. Die Entwicklung
der Röntgenfilme konnte sofort erfolgen.
2.4 Chromatographische Methoden
2.4.1 Prinzip der Gelfiltration
Mit Hilfe der Gelfiltration lassen sich Moleküle in Lösung aufgrund unterschiedlicher
Größe trennen, indem sie durch eine mit einem Gel gepackten Säule fließen. Das Gel ist