Protein ? Disassembly im Verlauf der endosomalen Prozessierung
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Material und Methoden Seite 36<br />
<strong>Protein</strong>s mehr Fragmente nachgewiesen werden als bei <strong>der</strong> herkömmlichen Methode <strong>der</strong><br />
125Iod-Markierung.<br />
Bei <strong>der</strong> Markierungsreaktion reagiert ein aktiver Digoxygenin- bzw. Fluoresceincapron-<br />
säure-Succinylester mit den pr<strong>im</strong>ären Aminogruppen <strong>der</strong> zu markierenden <strong>Protein</strong>e, vor<br />
allem mit <strong>der</strong> ε- Aminogruppe <strong>der</strong> Aminosäure Lysin. Bei <strong>der</strong> Reaktion wird <strong>der</strong> Succiny-<br />
lester abgespalten. Durch den Capronsäure - Anteil werden bei <strong>der</strong> späteren Bindung<br />
des Fab - Fragments bzw. Streptavidin sterische Hin<strong>der</strong>ungen min<strong>im</strong>iert. Die Markie-<br />
rungsreaktion findet bei einem basischen pH - Wert statt.<br />
2.3.5.1 Materialien und Lösungen<br />
• Markierungslösung 100 mM Natriumhydrogencarbonat<br />
500 mM NaCl, pH 8,3<br />
• Dialysierschlauch mit MV-Cutoff von 10 000 D (Serva)<br />
• Fluoresceinlösung 10 mg/ 100 µl DMSO D-Biotinoyl-ε-aminocaproicacid-N-hydroxysuccin<strong>im</strong>id-ester<br />
• Digoxygeninlösung 1mg/ 100µl DMSO Digoxigenin-3-0-methyl-carbonyl-ε-aminocaproicacid-<br />
N-hydroxysuccin<strong>im</strong>id-ester<br />
2.3.5.2 Durchführung <strong>der</strong> Markierungsreaktion<br />
Vor <strong>der</strong> Markierungsreaktion wurde die benötigte Menge an Markierungsreagens ausge-<br />
rechnet. Da <strong>der</strong> aktivierte Ester mit <strong>der</strong> ε- Aminogruppe <strong>der</strong> Lysine reagiert, wurde zu-<br />
erst die Anzahl <strong>der</strong> vorhanden Lysine <strong>im</strong> <strong>Protein</strong>molekül best<strong>im</strong>mt. Diese Wert wurde<br />
um eins erhöht, um auch den N - Terminus des <strong>Protein</strong>s zu berücksichtigen. Nun wurde<br />
die Molzahl des abgewogenen <strong>Protein</strong>s errechnet, und dieser Wert mit <strong>der</strong> Anzahl <strong>der</strong><br />
Lysine + 1 multipliziert. Hieraus konnte nun die benötigte Menge an Markierungsrea-<br />
gens errechnet werden. Da die Markierungsreaktion nicht quantitativ verläuft und eine<br />
Reaktionseffizienz von 70% angenommen wird, wurde die errechnete Menge an Markie-<br />
rungsreagens mit dem Faktor 1,4 multipliziert.<br />
Das abgewogene <strong>Protein</strong> wurde in <strong>der</strong> Markierungslösung gelöst und mit <strong>der</strong> errechne-<br />
ten Menge an Markierungslösung versetzt. Die Reaktion fand in 2 ml Bechergläsern, in<br />
denen sich ein Mini - Rührfisch befand, für 2h auf einem Magnetrührer bei Raumtempe-<br />
ratur statt. Um Flüssigkeitsverluste zu vermeiden, wurden die Bechergläser mit Parafilm<br />
verschlossen.<br />
Nach Abschluss <strong>der</strong> Markierungsreaktion wurde die Lösung in einen Dialysierschlauch<br />
eingebracht, <strong>der</strong> an beiden Enden mit Gefrierbeutelklammern verschlossen wurde. Ein
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