Protein ? Disassembly im Verlauf der endosomalen Prozessierung

Material und Methoden Seite 17
Stretchfilm NESCO- Film, Best. Nr. 2569 (Roth, Karlsruhe)
Zellkulturflaschen 50, 260 und 800 ml Fassungsvermögen (Nunc)
Zellkulturplatten Platten mit 24 Vertiefungen (Costar)
Platten mit 96 Verfiefungen (Titertek)
Zentrifugenröhrchen 10 ml Rundboden, Typ 163177 (Greiner, Nürtingen)
10 ml Spitzboden (Greiner, Nürtingen)
50 ml Spitzboden (Greiner, Nürtingen)
2.1.3 Chemikalien und Reagenzien
Chemikalien und Reagenzien wurden - wenn nicht anders vermerkt- in p.a. Qualität von
den Firmen Fluka (Neu-Ulm), Merck (Darmstadt), Roth (Karlsruhe), Pierce (Bruchsal)
oder Sigma (Deisenhofen) bezogen. Das Wasser in bidestillierter Qualität, u.a. zum An-
setzen von Lösungen, stammte aus einer Millipore Entmineralisierungsanlage (Millipore,
Eschborn).
2.1.4 Puffer für proteinbiochemische Arbeiten
• PBS - Stammlösung. 1,4 M (81,8 g/l) NaCl
0,1 M (15,6 g/l) NaH2PO4*2H2O
• Lämmli - Probenpuffer 62,5 mM (75,6 mg/ml) TRIS pH 6,8
0,77 M (63 ml/ml) 2- Mercaptoethanol
2% SDS (100ml SDS 20%)
10 % (v/v) Glyzerin (100 ml/ml)
• Phosphatpuffer 9 ml 1 M Na2HPO4
91 ml 1 M NaH2PO4
mit Aqua bidest auf 1 L auffüllen, pH 5,9
• Acetatpuffer 0,1 M HAc/ 0,1 M NaAc; pH 4,6
• TBS 50 mM (6,05 g/l) TRIS
150 mM (8,76 g/l) NaCl
mit HCl auf pH 7,5 eingestellt
2.1.5 Detergentien
SDS: Sodium - Dodecylsulfat ist ein ionisches Detergens, das es dem Proteinchemiker
erlaubt, Proteine in einem Agarose- oder Polyacrylamidgel nach ihrem Molekulargewicht
aufzutrennen. Die SDS- Moleküle denaturieren die meisten Proteine bei gleichzeitiger
Inaktivierung und umgeben diese gleichmäßig mit einem Monolayer. Durch die negative
Ladung der SDS- Moleküle und der gleichmäßigen stöchiometrischen Ummantelung
wandern die SDS- ummantelten Proteine gemäß dem Molekulargewicht zur Anode.
Nonident P 40: Nonident P 40 ist ein Ethylenphenol - Polyethylenglycolether
([C30H54O12]n) und hat ein Molekulargewicht von 606 D bei n = 11. Es ist ein nichtioni-