Protein ? Disassembly im Verlauf der endosomalen Prozessierung

Material und Methoden Seite 24
2.2.4 Organentnahme und Zellpräparation
2.2.4.1 Knochenmarkpräparation
Materialien und Reagenzien:
• Präparierbesteck (Witegro, Taunusstein)
• Zentrifugenröhrchen (50 ml)
• 5 ml Injektionspritze mit 0,7 mm (18 G) Kanüle
• MEM/ 1% FCS, auf Eis gekühlt
Das rote Knochenmark in den Markhöhlen der langen Röhrenknochen stellt ein häma-
topoetisches Organ dar, in dem sich die pluripotenten Stammzellen des Blutsystems so-
wie reife und unreife Formen von Leukozyten, Erythrozyten und Thrombozyten befinden.
Die Knochenmarkspräparation erfolgte unter sterilen Bedingungen. Die Versuchstiere
wurden durch das Einleiten von Kohlendioxid in einen Exsikator getötet und mit Nadeln
dorsal auf einer Präparierunterlage fixiert. Nach Desinfektion des Felles mit Alkohol
wurde die Haut an Abdomen, Vorder- und Hinterextremitäten abpräpariert. Femur und
Tibia wurden weitgehend von Muskeln befreit, von Hüft- und Fußgelenken abgetrennt
und anschließend vom Kniegelenk befreit. Die Röhrenknochen wurden mit Hilfe einer 5
ml Injektionsspritze und aufgesetzter 0,7 mm Kanüle mit kaltem MEM/1% FCS durch-
spült. Das Knochenmark wurde in einem 50 ml Zentrifugenröhrchen gesammelt. Ent-
sprechend wurde bei der Präparation von Humerus und Radius vorgegangen. Um eine
Einzelzellsuspension zu erhalten, wurde das Präparat mit einer 5 ml - Pipette aufsus-
pendiert.
2.2.4.2 Lyse der Erythrozyten
Um die Knochenmarkspräparation von Erythrozyten zu befreien, wurde das Präparat
nach erfolgter Suspendierung für 10 min bei 4°C und 200xg zentrifugiert. Das Zellsedi-
ment wurde in 3 ml Gey´s Lösung suspendiert und 2 1/2 min bei Raumtemperatur un-
ter gelegentlichem Schütteln inkubiert. Anschließend wurden die Zellen zweimal mit
MEM/ 1% FCS gewaschen. Nach Bestimmung der Zellzahl wurden sie in Kultur ge-
nommen.