Protein ? Disassembly im Verlauf der endosomalen Prozessierung
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Ergebnisse Seite 98<br />
n<strong>im</strong>mt die Intensität <strong>der</strong> 40 kD Bande wie<strong>der</strong> ab. Ein Fragment mit einem Molekularge-<br />
wicht von 30 kD ist nach fünfzehn Minuten nachweisbar. Auch dieses n<strong>im</strong>mt an Intensi-<br />
tät mit zunehmen<strong>der</strong> Inkubationsdauer zu. Das Max<strong>im</strong>um wird nach zwei Stunden er-<br />
reicht, danach n<strong>im</strong>mt die Intensität <strong>der</strong> Bande wie<strong>der</strong> ab (Abb. 23 A).<br />
Die MHC Klasse II – negative Restpopulation nach <strong>der</strong> Magnetbeadseperation, die<br />
hauptsächlich aus Makrophagen und Granulozyten besteht, zeigt ein Abbauprofil ähn-<br />
lich den unst<strong>im</strong>ulierten Makrophagen. Obwohl hier gegenüber den DC´s die doppelte<br />
Zellzahl eingesetzt wurde, zeigen sich keinerlei Unterschiede in <strong>der</strong> Intensität <strong>der</strong> Signa-<br />
le. Das 40 kD Fragment ist ebenfalls nach 15 min nachweisbar, zeigt jedoch bereits<br />
nach einer Stunde das Intensitätsmax<strong>im</strong>um und n<strong>im</strong>mt mit weiterer Inkubationsdauer<br />
wie<strong>der</strong> ab. Das Max<strong>im</strong>um an Intensität wird nach vier Stunden erreicht. Die gleiche Ki-<br />
netik zeigt auch das Fragment mit einem Molekulargewicht von 30 kD. Dieses ist<br />
schwächer als das 40 kD – Fragment (Abb. 23 B).<br />
Beiden Versuchen ist gemein, das die Fragmente nur schwach nachgewiesen werden<br />
konnten. Trotz halber Zellzahl zeigen sich die DC´s hinsichtlich <strong>der</strong> <strong>Prozessierung</strong>sleis-<br />
tung den Makrophagen gleichwertig. Fragmente mit niedrigeren Molekulargewichten<br />
konnten aufgrund des steigenden Hintergrunds nicht nachgewiesen werden.<br />
3.1.14 Edmann – Sequenzierung <strong>der</strong> aus M∅ isolierten Fragmente von FITC-OVA<br />
Um weitere Informationen über die an <strong>der</strong> <strong>Prozessierung</strong> beteiligten <strong>Protein</strong>asen zu ge-<br />
winnen, wurden mehrere 24-well Platten mit ausplattierten Makrophagen nach dem<br />
Standardprotokoll für 4h mit FITC – OVA inkubiert. Nach <strong>der</strong> Solubilisierung <strong>der</strong> Zellen<br />
wurde das Solubilisat abgezogen, vereinigt und mittels einer Centricon mit einem Aus-<br />
schlussvolumen von 10 kD aufkonzentriert und auf einem präparativen Polyacrylamdid<br />
- Gel aufgetrennt. Nach Blotten <strong>der</strong> <strong>Protein</strong>e auf eine Sequenziermembran und wurde<br />
das40kDFITC-OVAFragment vonHr.Prof.Meyer,Inst.f.Physiol.inBochumnach<br />
dem Edmann – Verfahren N - terminal ansequenziert. Aufgrund <strong>der</strong> hohen Salzkonzent-<br />
ration nach <strong>der</strong> Ankonzentrierung konnten die Banden nur schlecht voneinan<strong>der</strong> ge-<br />
trennt werden und liegen enger beieinan<strong>der</strong> (Abb. 24).
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