Protein ? Disassembly im Verlauf der endosomalen Prozessierung
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Material und Methoden Seite 26<br />
hingegen die Gewinnung ausreichen<strong>der</strong> Mengen an DC aus Vorläuferzellen des Kno-<br />
chenmarks <strong>der</strong> Ratte[86].<br />
2.2.6.1 Dendritische Zellen aus Knochenmarkskulturen<br />
Unter dem Einfluss von subopt<strong>im</strong>alen Mengen an GM-CSF differenzieren Knochen-<br />
markszellen zu Makrophagen, Granulozyten und Zellen mit dendritischer Morphologie.<br />
Zur Generierung wurden Knochenmarkszellen in einer Dichte von 5x10 5 Zellen/ml Kul-<br />
turmedium (DMEM, 5% FCS, 1% Gln), das mit 2 ng rekombinantem GM-CSF/ml Medi-<br />
um supplementiert worden war, für 8 Tage in großen Petrischalen ohne Beschichtung<br />
kultiviert[ 87 a - b].<br />
Bei <strong>der</strong> Zellernte wurde zuerst das Medium mit den nichtadhärenten Zellen entfernt und<br />
durch kaltes Versen ersetzt. Nach zehnminütiger Inkubation bei 4°C ließen sich die ad-<br />
härenten Zellen leicht vom Kulturschalenboden abspritzen.<br />
2.2.6.2 Anreicherung von DC aus Knochenmarkskulturen<br />
Bei <strong>der</strong> Generierung von DC aus Knochenmarkskulturen differenzieren neben DC auch<br />
Granulozyten und Makrophagen aus, so dass weitere Schritte zur Anreicherung<br />
erfor<strong>der</strong>lich sind. Da DC konstitutiv MHC - Klasse II Moleküle <strong>im</strong> Unterschied zu den<br />
an<strong>der</strong>en Zellpopulationen <strong>der</strong> Knochenmarkskultur expr<strong>im</strong>ieren, bot sich eine<br />
Separation über Klasse II mit Hilfe von Immunobeads an. Hierbei handelt es sich um<br />
magnetische Partikel, die von Polystyrol umhüllt sind und auf <strong>der</strong>en Oberfläche anti -<br />
Maus IgG kovalent gebunden ist. Mit Hilfe eines gegen Klasse II gerichteten<br />
Sekundärantikörper können so DC <strong>im</strong> Magnetfeld selektiert werden [88].<br />
2.2.6.3 Beladung von magnetischen Partikeln mit Antikörper<br />
Die Beladung <strong>der</strong> Immunobeads mit monoklonalen Antikörper erfolgte durch Inkubation<br />
von Hybridomüberstand mit Immunobeads in einer Konzentration von 1ml/2x10 7<br />
Beads. Während <strong>der</strong> mindestens zweistündigen Inkubation bei 4°C wurden die Partikel<br />
durch Rotation des Ansatzes in <strong>der</strong> Schwebe gehalten. Nach Abschluss <strong>der</strong> Inkubation<br />
erfolgten zwei Waschschritte mit MEM/1% FCS, wobei die paramagnetischen Partikel<br />
durch das Magnetfeld des Zellseperators <strong>im</strong> Reaktionsgefäß zurückgehalten und das<br />
Medium mit einer Pasteurpipette abgezogen wurde. Die Partikel wurden anschließend in<br />
einer Dichte von 4 x 10 8 Beads/ ml MEM/1% FCS aufgenommen.
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