Protein ? Disassembly im Verlauf der endosomalen Prozessierung
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Ergebnisse Seite 66<br />
3.1 <strong>Protein</strong>biochemische und molekularbiologische Untersuchungen<br />
Mit Hilfe proteinchemischer Methoden wurde die <strong>Prozessierung</strong> des Modellantigens<br />
Ovalbumin in Makrophagen und DC´s untersucht. Um den Abbau untersuchen zu kön-<br />
nen, wurde das Ovalbumin – Molekül mit Fluorescein markiert. Das markierte Ovalbu-<br />
min, FITC-OVA, wurde mit einer definierten Zellzahl in 24 Well Platten inkubiert. Um<br />
einen möglichen Einfluss des Aktivierungszustandes <strong>der</strong> Zelle auf die Degradierung des<br />
Modellantigens FITC-OVA zu untersuchen, wurde ein Teil <strong>der</strong> Makrophagen mit γ -Inter-<br />
feron o<strong>der</strong> LPS st<strong>im</strong>uliert. Durch Kinetikanalysen konnte <strong>der</strong> Abbau des markierten O-<br />
valbumin verfolgt werden. Durch Präinkubation mit <strong>Protein</strong>ase- Gruppen spezifischen<br />
Inhibitoren wurde versucht, die an <strong>der</strong> <strong>Prozessierung</strong> beteiligten <strong>Protein</strong>asen einzugren-<br />
zen. Für den Nachweis <strong>der</strong> Ovalbuminfragmente wurden die Zellen nach zwe<strong>im</strong>aligem<br />
Waschen in PBS in den 24 Well Platten mit Hilfe von Detergentien lysiert. Dieses Solubi-<br />
lisat wurde gelelektrophoretisch getrennt und ausgewertet. Die Abb. 9 gibt einen sche-<br />
matischen Überblick über den Versuchsablauf.<br />
3.1.1 Aufreinigung des Modellprotein Ovalbumin<br />
Um Aussagen über die Prozessivität des Modellproteins Ovalbumin zu treffen, war es<br />
wichtig, über ein definiertes Ausgangsmaterial zu verfügen. Das in höchster Reinheit<br />
käuflich erhältliche Ovalbumin (OVA Grade VII) zeigte für den Einsatz in Prozessie-<br />
rungsstudien einige Nachteile : Durch die Aufreinigungsprozedur wurde das <strong>Protein</strong> de-<br />
manosyliert, was eine effiziente rezeptorvermittelte Endozytose verhin<strong>der</strong>te. Zweitens<br />
wurde das Molekül durch die chemische Behandlung thermisch instabil. So zeigten Ex-<br />
per<strong>im</strong>ente, dass wie<strong>der</strong>holtes Auftauen und Einfrieren des gelösten Moleküls zu dessen<br />
Fragmentierung führte. Um ein eindeutig charakterisiertes, natives <strong>Protein</strong> zu erlangen,<br />
wurde Ovalbumin in geringer Reinheit (OVA Grade II) gekauft und durch Anionenaus-<br />
tausch-Chromatographie aufgereinigt. Hierbei wurde die Tatsache ausgenutzt, dass die<br />
Hauptverunreinigungen Conalbumin und Lysozym nicht an die anionische Matrix bin-<br />
den. Durch dieses Verfahren konnte reines Ovalbumin gewonnen werden. Eine nachfol-<br />
gende Gelfiltration brachte keinen weiteren Reinigungseffekt.
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