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’Schadstoffbelastung nach dem Augusthochwasser 2002 - Ergebnisse und Forschungsbedarf’ Schicksale fakultativ pathogener Mikroorganismen während und nach dem Sommerhochwasser an Elbe und Mulde Wolf-Rainer Abraham, Dirk F. Wenderoth GBF - Gesellschaft für Biotechnologische Forschung mbH, Umweltmikrobiologie, Mascheroder Weg 1, 38124 Braunschweig, Tel. 0531/6181-419, Fax 0531/6181-411, wab@gbf.de 1 Einleitung Nach dem Rückgang des Wassers aus den von der Flutkatastrophe der Elbe und der Mulde betroffenen Städten, ist der vom Wasser eingetragene Schlamm zurückgeblieben. Dieser Schlamm ist in einem unbekannten Maße mit potentiell pathogenen Mikroorganismen angereichert, die größtenteils durch die Überflutung von Klärwerken und der Kanalisation in die Umwelt gelangten und an die Schlammpartikel gebunden sedimentierten. Diese Mikroorganismen stellen in geringen Konzentrationen keine Gefährdungen dar, sondern sind sogar Bestandteil der normalen menschlichen und tierischen Bakteriengemeinschaft. Durch den hohen Schlammeintrag erreichen die Bakterien allerdings eine solch hohe Konzentration, dass sie pathogen wirken können. Somit stellt der Schlamm mit seinen Mikroorganismen in den Kellern der Häuser, auf den Spielplätzen und zum Teil in den Strassen beim Kontakt ein pathogenes Potential für den Menschen dar. Um das Gefährdungspotential für die Menschen abschätzen zu können, ist ein grundlegendes Verständnis über das Vorkommen und das Schicksal der pathogenen Bakterien im Schlamm des Hochwassers, welches in diesem Ausmaß in Deutschland noch nicht vorgekommen ist, erforderlich. Um zu dieser zentralen Frage einen Beitrag zu leisten, wurden zunächst die Keimzahlen der Bakterien im Schlamm von verschiedenen Probenahmestandorten auf Selektivmedien bestimmt und die im Schlamm vorkommenden Bakterien phylogenetisch analysiert. Dazu wurden die Nukleinsäuren extrahiert und ein Abschnitt der 16S rRNA Gene in einer Polymerase Kettenreaktion (PCR) amplifiziert. Die Amplikons wurden anschließend sequenz-spezifisch in einer single-strand conformation polymorphism (SSCP) Analyse aufgetrennt. Diese Analyse erlaubt den Vergleich der Biodiversität in verschiedenen Umweltproben und die Bestimmung der einzelnen Bakterienarten in einer Umweltprobe (Lünsdorf et al., 2001). Aus den so erhaltenen einzelnen Fingerprints können dann Sequenzinformationen gewonnen werden, um Bakterienarten zu identifizieren und um real time PCR-Sonden zu generieren, die dann die einzelnen pathogenen Bakterien schnell in den jeweiligen Proben (Wasser oder/und Schlamm) quantifizieren können (Lübeck und Hoorfar, 2003). Hierzu sind Keimzahlbestimmungen der einzelnen Bakteriengruppen auf Selektivagarnährböden unerlässlich. Zwar wachsen auf diesen Medien nicht nur fakultativ pathogene Bakterien, sondern auch eng verwandte Stämme, welche auch in der Umwelt vorkommen, aber nicht pathogen sind, die Keimzahlen auf den unterschiedlichen Medien stellen aber eine erste wichtige Größe bei derartigen Untersuchungen dar (Strauba und Chandlerb, 2003). So können kritische Bereiche identifiziert werden, in denen diese Bakterien längere Zeit eine Gefahr darstellen und geeignete Gegenmaßnahmen ergriffen werden. Die Kenntnis solcher Reservoirs pathogener Bakterien erlaubt ihre sehr gezielte Bekämpfung nach entsprechenden Katastrophen und damit die Abwehr einer möglichen Gefährdung für die betroffenen Menschen. 2 Ergebnisse Bei zwei Serien von Beprobungen mit einem mobilen Feldlabor in der Stadt Hitzacker (Elbe) und im Kreis Bitterfeld (Mulde) wurden aus überschwemmten Kellern, Gartenteichen und Brunnen Wasserproben genommen und anschließend in der GBF im Labor mikrobiologisch untersucht. Als Sofortmaßnahme nach der Flut wurde z. T. eine Desinfektion der Gebäudeteile 6
<strong>Tagungsband</strong> Statusseminar des BMBF-Ad-hoc-Verbundprojektes in Freiberg, 27.-29.08.2003 propagiert, welche mit dem Flutwasser in Berührung gekommen waren. Wo diese Desinfektion vorgenommen wurde, wurden von uns keine Proben genommen, um den Datensatz nicht zu divers zu machen. Die Proben werden vor Ort fixiert bzw. eingefroren, um eine nachträgliche Veränderung der mikrobiellen Gemeinschaften zu verhindern. Der Teil der Proben, welcher für die Kultivierung auf Selektivagar-Nährböden vorgesehen war, wurde unmittelbar nach der Rückkehr ins Labor ausplattiert. Die Agarnährböden wurden nach den EU-Richtlinien für Gewässerhygiene kultiviert und die entstehenden Kolonien wurden ausgezählt, wobei nach verschiedenen Koloniefarben unterschieden wurde. Zunächst wurden Keimzahlen auf Selektivagarnährböden zur klassischen Bestimmung von pathogenen Bakterien (coliforme Keime, Salmonellen) bestimmt. Hierzu kamen Salmonella Shigella Agar (Escherichia, Enterobacter, Salmonella, Shigella, Proteus), Gassner Agar (Escherichia, Staphylococcus), Bile Aesculin Agar (Enterococcus, Streptococcus) und Endo Agar (Escherichia, Enterobacter, Klebsiella) zum Einsatz. Anschließend wurden von den Platten Bakterienstämme isoliert und phylogenetisch identifiziert (über den Vergleich mit Referenzstämmen bzw. mittels Sequenzierung der 16S rRNA Gene). Diese Stämme werden dann auf ihre Resistenz gegenüber verschiedenen Antibiotika getestet. Die auf den verschiedenen Nährböden bestimmten Keimzahlen gaben zunächst Auskunft über das pathogene Potential der einzelnen Proben. Eine genauere Charakterisierung wurde dann schließlich in den SSCP Fingerprint-Analysen erreicht, welche auf den Nukleinsäuren basieren, die zum einen aus den Umweltproben und zum anderen aus den auf den Nährböden gewachsenen Kolonien gewonnen wurden. Hierzu wurde ein Stück der 16S rRNA Gene mittels PCR amplifiziert und unter SSCP-Bedingungen analysiert. Die Identifizierung der Banden erfolgte zum einen über den Vergleich mit Referenzstämmen, die in unserer großen Stammsammlung zahlreich vorhanden sind. Zum anderen wurden aber auch prominente und/ oder charakteristische Banden aus dem Gel ausgeschnitten und anschließend sequenziert. Die erhaltenen Sequenzen wurden dann über die öffentlich zugänglichen 16S rDNA Datenbanken Abbildung 1: Keimzahlen BFT und Hitzacker 280000 260000 240000 220000 200000 cfu/ml 180000 160000 140000 120000 100000 80000 60000 40000 20000 0 1 2 3 4 5 6 8 9 10 11 13 14 15 Probe Endo Agar Bile - Äsculin Agar Gassner Agar SS Agar 7
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