Angelika Semmler - KOPS - Universität Konstanz

5 Anwendung der Methode
Die Immobilisierung des Streptavidins auf dem Chip erfolgte nach dem von Biacore
empfohlenen Standardprotokoll [126] durch Aktivierung der Carboxylgruppe auf der
Dextranoberfläche mit N-Ethyl-N’-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimid (EDC) und
N-Hydroxysuccinimid (NHS). Durch die Aktivierung bildet sich ein Aktivester, der
dann mit primären Aminofunktionen des Streptavidins (ε-Aminofunktion der Lysin-
seitenkette) reagieren kann (Abb. 5.13). Nach der Belegung der Oberfläche mit
Streptavidin wurden noch aktive Carboxylfunktionen durch Injektion von Ethanolamin
gecappt. Eine der vier Messzellen des CM5-Chips wurde als Referenzzelle
verwendet. Ihre Behandlung erfolgte analog zur Messzelle, jedoch ohne Streptavidin-
injektion.
Die Bindungsstudien erfolgten mit den oben beschriebenen Peptiden (93/92, 97/96,
95/94). Zunächst wurden die Messungen mit Peptidlösungen in einem
Konzentrationsbereich von 0,33-677 µM im Falle der linearen bzw. 0,36-731 µM im
Falle der cyclischen Peptide durchgeführt. Die Lösungen wurden als 1:1 Verdün-
nungsreihe hergestellt. Zur Regenerierung der Chipoberfläche musste lediglich mit
Laufpuffer gespült werden. Die Auswertung erfolgte als Differenzmessung, hierfür
wurde das Signal der Referenzzelle vom Signal der eigentlichen Bindungsmesszelle
subtrahiert. Somit kann sichergestellt werden, dass ausschließlich die tatsächlich
auftretende Interaktion zwischen Streptavidin (Ligand) und Peptid (Analyt) untersucht
wird. Die erhalten Sensorgramme wurden durch Anwendung der Steady-State-
Affinity-Methode mit der Herstellersoftware ausgewertet.
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