Angelika Semmler - KOPS - Universität Konstanz

5 Anwendung der Methode
Tabelle 6 Übersicht der Versuchsbedingungen zur Optimierung des enzymkatalysierten
Farbreaktionstests. Die wichtigen Unterschiede in den Bedingungen sind fett
hervorgehoben.
Zweck Puffer Versuch 1 Versuch 2 Versuch 3 Versuch 4 Versuch 5
Waschen
Wasser 5x1 min 5x1 min 5x1 min 5x1 min 5x1 min
PBS 1x10 min
4x1 min
2x5 min
7x1 min
2x5 min
4x 1min
2x5 min
4x1 min
2x5 min
4x1 min
Blocken 0,1% Gelatine Über Nacht Über Nacht Über Nacht Über Nacht Über Nacht
Waschen
(pH 7,4)
0,1% Tween in
PBS
*: 0,1% Tween,
0,1% Gelatine
in PBS
4x1 min
1x15 min
Anlagern SA-AP in * 2,5 h
Waschen 0,1% Tween in
PBS
6x1 min 1x15 min
4x1 min
1x15 min
4x1 min
1x15 min
4x1 min
5x1 min 5x1 min 5x1 min 5x1 min 5x1 min
0,1 µg/ml
Umpuffern TBS 2x3 min
3,5 h
1 µg/ml
3,5 h
1 µg/ml
3,5 h
1 µg/ml
3,5 h
1 µg/ml
neu gekauft
10x1 min 9x1 min 15x1 min 15x1 min 15x1min
8x1 min
pH 8,0
8x1 min
1x5 min
pH 8,0
15x1 min
pH 8,0
15x1 min
pH 9,5
15x1 min
pH 9,0
Farbreaktion BCIP/NBT 1 h 5 min 30 min 30 min 30 min
quenchen 0,1 M HCl 1x 0,5 min 1x 0,5 min 1x 0,5 min 1x 0,5 min 1x 0,5 min
Im ersten Versuch erfolgte die Inkubation mit einer Streptavidin/Alkalische-
Phosphatase-Konjugat (SA-AP-Konjugat)-Lösung der Konzentration 0,1 µg/ml.
Selbst nach 1h Farbreaktionszeit war jedoch keine Anfärbung der Kugeln zu
beobachten (Abb. 5.5 Bild h). Daraufhin wurde im zweiten Versuch die SA-AP-
Konjugatkonzentration auf 1 µg/ml erhöht. Bereits nach 5 Minuten konnte eine
deutliche Anfärbung der Harzkugeln in beiden Positivkontrollen beobachtet werden.
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