Angelika Semmler - KOPS - Universität Konstanz

4 Analytik
des intakten Peptidions (in Abb. 4.5 unten) verdeutlicht diese Tatsache. Sieht man
von der Fragmentierung der Pbf-Schutzgruppe und der Aminofunktion am C-
Terminus ab, ist das Mutterion (intaktes Peptid) im Wesentlichen nur an einer Stelle
gebrochen, nämlich N-terminal zu Prolin. Die weitere Fragmentierung dieses Ions
(MS(3)-Spektrum) ergab zwar Informationen über die Sequenz, jedoch handelt es
sich dabei um Signale mit einer Intensität von 0,4-19% (Tabelle 4). Die Information
wurde also mehr gesucht als gefunden. Hiermit sind wir an einer Schwachstelle der
De-novo-Sequenzierung angelangt.
Eine ideale Dissoziationsmethode sollte die Bindungen des Peptidrückgrats wahllos
brechen, unabhängig von Peptidlänge, Ladung, m/z-Verhältnis, sterischer Anord-
nung, Aminosäurenzusammensetzung und –abfolge. Eine solche Methode existiert
jedoch nicht. [80] Während der stoßinduzierten Fragmentierung (CID) wird dem
Mutterion in sehr kurzer Zeit (Pico- bis Mikrosekunden) Energie zugeführt, was zum
Bruch der schwächsten Bindung im Molekül führt. Diese schwächste Bindung ist eine
protonierte Amidbindung. Innerhalb eines Peptids besitzen Amidstickstoffe jedoch
unterschiedliche pKb-Werte; somit unterscheiden sie sich in ihrer Labilität und
verhalten sich nicht ideal. [81] Die N-terminale Seite von Prolin gilt als äußerst labile
Stelle. Diese Beobachtung wird in der Literatur als Prolin-Effekt bezeichnet [82] . Hier
führt nicht, wie früher angenommen, die Protonenaffinität von Prolin zur
Fragmentierung, sondern die sterische Instabilität der Prolin-Bindung. [83-85] Es
existiert eine Vielzahl von zum Teil kontrovers diskutierten massenspektrometrischer
Fragementierungsmechanismen, einige davon wurden von Zhang [81] zusammen-
getragen.
Ein weiterer kritischer Punkt ist die Probenkonzentration und -menge. Alle in der
Arbeit durchgeführten De-novo-Sequenzierungsexperimente erfolgten nach einer
Testabspaltung vom Harz. Hierzu wurde das Peptid von 0,5-10 mg Harz, was in etwa
400-8000 Harzkugeln entspricht, abgespalten und anschließend in 50-100 µl
Lösungsmittel aufgenommen. Bei einem kombinatorischen Ansatz stünde jedoch nur
eine einzige Harzkugel zur Verfügung. Zur erfolgreichen Durchführung der MS(n)-
Experimente am für diese Arbeit zur Verfügung stehenden Massenspektrometer
(Esquire3000 plus ohne Nanoquelle) werden ca. 50 µl Probenlösung benötigt. Dies
würde einer 3 µM-Lösung entsprechen, was unter der Nachweisgrenze des Geräts
liegt.
54