Angelika Semmler - KOPS - Universität Konstanz

8 Experimenteller Teil
AAV 16 Basisches Spalten von HMBA-bzw. Glykolamidester-Harz
Zur basischen Abspaltung des Peptids vom HMBA- bzw. Glykolamidester-Harz wird
die gewünschte Menge Peptidylharz in eine Einwegspritze mit eingesetzter PE-Fritte
eingewogen. Das Harz wird 5 min mit DMF vorgequollen. Man stellt eine Lösung aus
Propylamin, DMF und Triethylamin (5:5:1) her und behandelt das Harz bei RT mit
dieser Lösung (50 ml/g). Nach 18 h wird die Lösung abgetrennt. Das Harz wird mit
DMF (7x1 min), Methanol (2x1 min), Wasser (2x1 min) und Methanol (2x1 min)
gewaschen. Die aufgefangene Waschlösung wird mit der basischen Abspaltlösung
vereinigt und am Stickstoff-Rotationsverdampfer bis zur vollständigen Trockne
eingeengt. Der Rückstand wird in Wasser aufgenommen (eventuell zuerst einige
Tropfen Acetonitril zum Lösen), mit flüssigem Stickstoff ausgefroren und lyophilisiert.
Das Peptid kann anschließend mittels RP-HPLC und Massenspektrometrie
charakterisiert werden.
AAV 17 Peptidabspaltung vom SieberAmid-Harz
Unmittelbar vor Gebrauch wird eine Lösung aus TFA/TIS/Wasser (1:1:98) hergestellt.
Peptidabspaltung von einzelnen Kugeln für anschließende MALDI-TOF-
Analyse
Die Kugeln werden in Eppendorf-Caps (500 µl / transparent) überführt, wobei in
jedem Cap immer nur eine Kugel sein darf (unter der Stereolupe überprüfen). Nach
einem kurzen spindown in der Zentrifuge werden je 100 µl TFA/TIS/DCM (1:1:98)
hinzugefügt. Nach einer Stunde wird die Lösung am Stickstoffgegenstrom eingeengt.
Zum Rückstand werden 5 µl 0.1% TFA in Wasser/ Acetonitril (1:1) addiert, um das
vom Harz abgespaltene Peptid aufzunehmen. 0,5 µl der Peptidlösung und 0,5 µl
Matrixlösung (gesättigte 4-Hydroxy-α-cyanozimtsäure in 0,1% TFA in Wasser/
Acetonitril (1:1) werden auf dem MALDI-target gemischt und können nach
Kristallisation analysiert werden.
Abspaltung von mehreren Harzkugeln
Zum Abspalten des Peptids vom Harz wird das Peptidylharz in eine Einwegspritze
mit PE-Fritte eingewogen und mit DCM quellen lassen. Das Harz wird bei RT mit
einer Lösung aus TFA/TIS/DCM (1:1:98) behandelt (2x15 min, 1x 30 min).
Anschließend wird zehnmal je 1 Minute mit DCM, zweimal je 4 Minuten mit Methanol
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