Angelika Semmler - KOPS - Universität Konstanz

8.5.4 Partielle Edman-Sequenzierung
8 Experimenteller Teil
Die positiv getesteten violetten Harzkugeln (Hitbeads) wurden mit einer Glaskapillare
separiert und in einer 2 ml–Spritze mit PE-Fritte vereinigt (der PED erfolgte für alle
Hitbeads gemeinsam). Zum Abstreifen des Streptavidin-Alkalische Phosphatase-
Konjugats wurden die Kugeln 1x5 min und 4x1 min mit 6 M Guanidin-HCl Lösung
(pH 1,0) behandelt. Anschließend wurde je 5x1 min mit Wasser und Acetonitril
gewaschen und am Ölpumpen-Vakuum getrocknet. Zum Waschen und pH-Wert-
Einstellen wurden die Kugeln der Reihe nach mit DCM (3x1 min), Acetonitril (3x1
min), Wasser (3x1 min), Pyridin (3x1 min) und 0,1% Triethylamin in Pyridin/Wasser
(2:1) behandelt. 480 µl FmocOSu-Lösung (5,4 mg in 480 µl Pyridin / 0,03 M) und
54 µl Phenylisothiocyanat (0,45 mmol) wurden unmittelbar vor Gebrauch gemischt,
zum vorbehandelten Harz aufgezogen und 8 min reagieren lassen. Daraufhin wurde
je 3x1 min mit Pyridin, Acetonitril und DCM gewaschen. Nach saurer Spaltung mit
TFA (1x1 min und 2x6 min) erfolgte ein erneuter Durchgang des PED. Die PED-
Zyklen wurden (n+1) mal wiederholt, wobei n die Anzahl der zu sequenzierenden
Aminosäuren darstellt. Beim letzten PED-Durchlauf wurde nach der sauren Spaltung
mit TFA je 3x1 min mit DCM, Pyridin und DCM gewaschen. Mit 20% Piperidin in DMF
(1x1 min, 3x5 min) wurde das Fmoc-Capping aufgehoben und 10x1 min mit DMF
und 5x1 min mit DCM gewaschen. Für die MALDI-TOF Analyse wurden die Kugeln
nun in Eppendorf-Caps (500 µl / transparent) überführt, wobei in jeden Cap immer
nur eine Kugel sein durfte (unter der Stereolupe überprüfen). Nach einem kurzen
spindown in der Zentrifuge wurden je 10 µl Bromcyan-Lösung (40 mg BrCN in 1 ml
70% TFA aq.) hinzugefügt und über Nacht einwirken lassen. Nach Trocknen am
Vakuum wurde das vom Harz abgespaltene Peptid in 5 µl Solvent A (0.1% TFA in
Wasser/Acetonitril (1:2)) aufgenommen. 0,5 µl der Peptidlösung und 0,5 µl
Matrixlösung (gesättigte 4-Hydroxy-α-cyanozimtsäure in Solvent A/MeOH (5:2)
wurden auf dem MALDI target gemischt.
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