Angelika Semmler - KOPS - Universität Konstanz

5 Anwendung der Methode
(pH 7-9.2) liegt. Wie die Fotos in Abb. 5.5 (obere Reihe) zeigen, konnten jetzt
optimale Ergebnisse erzielt werden. Sowohl das Harz, welches das positive
Kontrollpeptid trägt (Abb. 5.5 a) als auch das biotinylierte Harz (Abb. 5.5 b) sind
gleichmäßig von einem tiefschwarzvioletten „Lack“ überzogen. Das Harz welches
das Negativkontrollpeptid trägt (Abb. 5.5 c), sowie das unbeladene TentaGel-Harz
(Abb. 5.5 d) sind hingegen farblos.
5.3.2 Screening der OBOC-Cyclopeptidbibliothek 86
Abb. 5.6 Das Screening. A) Vorbereitung der OBOC-Cyclopeptidbibliothek. B) Strept-
avidinbindung. C) Auslösung der Farbreaktion.
Das Screening der OBOC-Cyclopeptidbibliothek 86 erfolgte nach den oben
beschriebenen optimierten Bedingungen (Abschnitt 5.3.1). Hierzu wurden zunächst
durch Zugabe von TFA/TIS/Wasser alle säurelabilen Schutzgruppen entfernt.
Daraufhin wurde das Peptidylharz ausführlich mit Wasser und PBS-Puffer
gewaschen. Das Harz wird dabei auf pH 7,4 eingestellt. In diesem Bereich liegt der
pI-Wert des Streptavidins. Das heißt, hier ist das Protein in der Gesamtladung
neutral und somit sind Bindungen nicht auf statische Wechselwirkungen, sondern auf
Erkennung zurückzuführen. Um unspezifische Wechselwirkungen zwischen
Harzkugeln und Streptavidin-Alkalische Phosphatase-Komplex (SA-AP-Komplex) zu
vermeiden, wurden die Harzkugeln über Nacht durch Inkubation mit Gelatine
geblockt. Nach gründlichem Waschen mit PBS-Puffer (+ 0,1% Tween + 0.1%
Gelatine) erfolgte dann eine dreistündige Inkubation mit SA-AP Konjugat, die
eigentliche Rezeptor-Ligand Screening-„Reaktion“. Anschließend wurden nicht
gebundene SA-AP-Komplexe durch Waschen mit PBS-Puffer (+ 0,1% Tween)
entfernt. Zur Aktivierung der Alkalischen Phosphatase erfolgt nun eine pH-
81